urocortin 致大鼠心肌细胞肥大由pka信号通路介导

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1、Urocortin致大鼠心肌细胞肥大由PKA信号通路介导：梁春光，王洪新，刘春娜，刘杰,黄雷【摘要】　　目的通过观察PKA拮抗剂H-89和CRF受体拮抗剂Astressin抑制U诱导乳大鼠心肌细胞肥厚的作用，研究U诱导的大鼠心肌细胞肥厚的信号转导机制。方法以体外培养的乳大鼠心肌细胞为模型，应用U0.1μmol·L-1诱导心肌肥大，观察H-890.1μmol·L-1和Astressin1μmol·L-1的作用，探讨U0.1μmol·L-1对心肌肥厚的作用机制。用消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积；［3H］亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白的合成；用etho

2、dsUsingthemyocardialcellsofneonatalratsculturedinvitroasmodels,andinducingmyocardialhypertrophybyusingU0.1μmol·L-1toobservetheeffectofH-890.1μmol·L-1andAstressin1μmol·L-1anddiscussthemechanismofeffectofU0.1μmol·L-1onmyocardialhypertrophy.Thecardiomyocytesvolumeseasuredbyputerphotogr

3、aphanalysissystem.Theproteinsyntheticrateeasuringtheincorporationof[3H]-leucineintomyocyteproteinbyliquidscintillationmethod.TheexpressionofANPinedbyyocytevolume,thesynthesisandtheexpressionofANP.H-890.1μmol·L-1andAstressin1μmol·L-1caninhibitmyocardialcellshypertrophyinducedbyU.Conc

4、lusionsThehypertrophiceffectofUinneonatalrats'cardiomyocytesismediatedviaCRF-R2andactivationofthePKApathyocardialcellshypertrophy;PKA;H-89　　Urocortin(U)是在1995年新发现的一个神经肽，研究发现U在心脏中［1］有表达，是一个很重要的心血管活性肽。U可以使新生大鼠心肌细胞ANP和BNP分泌显著增加［2］，而且UmRNA在肥大心肌上的表达数量明显比在正常心脏上的表达数量高［3］，均说明U参与心肌肥大作用。U与CRF

5、-R2具有很高亲和力［4，5］，实验表明U能够使心肌细胞内cAMP积聚增加［2］300。大量实验也表明PKA信号通路参与心肌肥厚作用。　　为了进一步探讨U诱导心肌肥厚的作用机制，本研究在U体外诱导心肌肥大基础上，重点观察应用PKA抑制剂H-89和CRF-R拮抗剂Astressin对心肌肥大的影响。　　1材料与方法　　1.1实验动物　　生后2～3d的SD乳大鼠，雌雄不拘，由辽宁医学院试验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（辽）2003-0007。　　1.2药品与试剂　　胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate,SDS）、DMEM培养基

6、、Urocortin、H-89(PKA抑制剂)、Astressin（CRH受体拮抗剂）均为美国Sigma公司；小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司；［3H］亮氨酸为上海原子核研究所产品；ANP一抗：Millipore公司；其他试剂均为分析纯。　　1.3体外乳大鼠心肌细胞培养　　在无菌条件下，取生后2～3d的SD大鼠心脏，放入Hanks液冲洗3次后，剪成约1mm3的小碎块，用0.8g·L-1胰蛋白酶消化分离细胞，向分离的细胞中加人15％的小牛血清，84％的DMEM培养基，1％的双抗液(含1×10U·L-1青霉素,100μg链霉素)的培养基，及0.1mmol/

7、L5-溴脱氧尿苷，吹打均匀后以1×109·L-1的密度接种于24孔培养板，送入通以5%CO2及95%空气的二氧化碳孵箱中培养。　　1.4分组及给药方法　　常规培养心肌细胞2d后，换液，为了减少血清成分对实验结果的影响，换液时更换含0.4％小牛血清的培养基及各种浓度的试剂。设对照组，其他组分别加入U(0.1μmol·L-1)；H-89（10μmol·L-1）；H-89+U；Ast（1μmol·L-1)；Ast+U。给药48h后进行各项指标的测定。　　1.5培养心肌细胞体积测量　　细胞体积是通过测量细胞直径获得的。用D-Hanks液快速冲洗长满细胞的培养孔3次，每

8、孔加0.3mL胰蛋白酶（1g·L-1）