ilkmrna在结肠癌细胞株中的表达及其稳定表达

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1、ILKmRNA在结肠癌细胞株中的表达及其稳定表达【摘要】　　［目的］检测结肠癌细胞株中ILK的mRNA水平，并构建针对ILK基因的特异性RNA干扰(RNAi)表达载体。［方法］通过RT-PCR检测ILK基因在三种结肠癌细胞株（Sethods］TheexpressionofILKmRNAacelllines（Sacelllines:SaybepotentiallyusefulingenetherapyofILKrelatedcoloncarcinoma.KeyRNA，达到阻止基因表达的作用，使细胞表现出特定基

2、因缺失的表型的过程，具有高特异性、高稳定性、高效率性、高穿透性、能同时抑制多个基因等特性[9]。RNAi是基因沉默的理想工具，可以直接用于疾病相关基因的抑制，从而达到疾病治疗或预防的目的。本实验是通过RT-PCR技术，检测ILKmRNA在结肠癌细胞系中表达情况，并构建其特异性的RNA干扰载体，抑制ILK基因表达，为结肠癌基因治疗提供了理论依据。1材料与方法1．1细胞株、质粒及菌株结肠癌细胞株SW480、HT29、LO-VO细胞为本实验室保存。含EGFP的pSUPER-neosiRNA表达载体（pSNE）由本

3、校戚华兵博士、何建明博士惠赠；大肠埃希菌DH5α为本实验室保存。1．2主要试剂限制性内切酶HindⅢ、BglⅡ和EcoRⅠ为Neine2000为Invitrogen公司产品。引物均由上海生工公司合成。1．3方法1．3．1结肠癌细胞总RNA的提取采用TRIzol法抽提总RNA（具体方法参见Invitrogen公司的TRIzol说明书）。1．3．2RT-PCR应用软件按照引物设计原则，设计ILK基因的上游引物5′-GCACTCAATAGCCGTAGTG-3′，下游引物5′-CCTACTTGTCCTGCATCTT

4、C-3′，产物长度为406bp。用β-actin作内参照：上游5′-GTCCTGTGGCATCCACGAAAC-3′，下游5′-GCTCCAACCGACTGCTGTCA-3′，产物长度为500pb。RT-PCR反应体系参照TaKaRa公司产品说明书。RNA逆转录为cDNA，经PCR扩增：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次，最后72℃延伸10min。取PCR扩增产物8μl于1%琼脂糖凝胶上电泳。阳性为2条带,分别为406bp的ILK条带和500bp的β-ac

5、tin。用Bio-Rad公司的GS-250MolecularAnalysis程序使PCR产物条带在计算机上显像，并应用BandScan软件分析ILK基因与β-actin条带光密度比，比值小于0.1时为阴性或低度表达，比值大于0.1小于0.4时为中度表达，大于0.4为高度表达。1．3．3RNA干扰载体的构建根据报道ILKsiRNA序列[10]及已发表的基因库中ILK基因的mRNA序列，利用软件设计，按照Oligoengine提供的pSUPER-RNAiSystem中构建发夹状短链RNA的原则，5′→3′分别为

6、BglⅡ酶切位点＋靶向正义链＋发夹状结构＋靶向反义链＋终止序列HindⅢ酶切位点，设计为：senseILK为：5′-GATCCCCCTCGTTGAGCTTCGTCAGGTTCAAGA-GACCTGACGAAGCTCAACGAGTTTTTA-3′，antisenseILK为：5′-AGCTTAAAAACTCGTTGAGCTTCGT-CAGGTCTCTTGAACCTGACGAAGCTCAACGAGGG-G-3′。无关基因对照组sense-Control为：5′-GATCCCCTCCGTTGAGCTTCGTCAG

7、GTTCAAGAGA-CCTGACGAAGCTCAACGGATTTTTA-3′，antisense-Control为：5′-AGCTTAAAAATCCGTTGAGCTTCGT-CAGGTCTCTTGAACCTGACGAAGCTCAACGAGGG-G-3′。将合成的单链稀释为3μg/μl，退火成双链，于4℃保存。用BglⅡ及HindⅢ双酶切质粒pSNE，1.0%琼脂糖凝胶电泳30min，纯化回收线性化质粒pSNE（按照BioDev胶回收试剂盒说明书进行）。T4DNA连接酶连接线性化质粒pSNE和退火产物，以线

8、性化质粒pSNE和灭菌水连接做阴性对照。4℃连接过夜后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（感受态细胞制备和转化参照《分子克隆指南》），在氨苄青霉素抗性的LB平板上37℃培养过夜筛选，随机挑取菌落，扩增培养后，抽提并纯化质粒，用EcoRⅠ及HindⅢ双酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定（阳性为281bp，阴性为227bp）。酶切鉴定正确的进一步测序鉴定。1．3．4RNA干扰载体细胞转染应用Lipofectamine200