堆肥中高效纤维素降解菌的筛选与鉴定

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1、堆肥中高效纤维素降解菌的筛选与鉴定李丹花，乔莉娟，岳丹，昝立峰，段保宁，白兰所（邯郸学院生命科学与工程学院，河北邯郸０５６００５）摘要：从邯郸地区堆肥中分离出５株具有纤维素降解能力的菌株，纤维素降解能力的初步鉴定结果显示，Ｍ１菌株具有较强的纤维素降解能力。对Ｍ１菌株进行分子鉴定和生长特性的初步鉴定，结果表明，Ｍ１菌株应当归属于假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．），菌株的温度生长范围为１０～４５°Ｃ，最适生长温度为３０°Ｃ，ｐＨ６～８菌株均可生长，最适条件为ｐＨ６。.jyqkL，加入玻璃珠振荡培养１ｈ备用。１．２培养基配方羧甲基纤维素钠培养基组分为：ＣＭＣ－Ｎａ１

2、０．００ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１．００ｇ、ＮａＣｌ０．１０ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．３０ｇ、ＮａＮＯ３２．５０ｇ、ＦｅＣｌ３０．０１ｇ、ＣａＣｌ２０．１０ｇ、琼脂１８．００ｇ、蒸馏水１Ｌ；刚果红纤维素琼脂培养基组分为：ＣＭＣ－Ｎａ１０．００ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１．００ｇ、ＮａＣｌ０．１０ｇ、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．３０ｇ、ＮａＮＯ３２．５０ｇ、ＦｅＣｌ３０．０１ｇ、ＣａＣｌ２０．１０ｇ、刚果红０．２０ｇ、琼脂１８．００ｇ、蒸馏水１Ｌ；ＬＢ培养基组分：蛋白胨１０ｇ，酵母提取物５ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，琼脂１５ｇ，蒸馏水１Ｌ，ｐＨ７．０。所有培养基于１２１℃下灭菌３０ｍｉｎ备用。１．

3、３菌种的分离纯化发酵物菌液按照梯度稀释法稀释，取稀释度为１０－２～１０－５的悬浊液２００μＬ分别涂布于羧甲基纤维素钠分离培养基中培养，培养物放入２８℃恒温箱培养，将长出的菌落接种至ＬＢ培养基上进行划线纯化。１．４分解纤维素能力鉴定将纯化好的菌株点接到刚果红纤维素琼脂培养基上，２８℃恒温箱培养５ｄ，量取透明圈直径（Ｄ）和菌圈直径（ｄ），并计算出比值HC（D/d）,从而判定菌株的纤维素分解能力。１．５菌株的分子鉴定用细菌ＤＮＡ提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）提取细菌基因组ＤＮＡ，以基因组ＤＮＡ为模板，２７Ｆ和１４９２Ｒ为１６ＳｒＤＮＡ引物进行分子鉴定。ＰＣＲ产物琼脂糖

4、凝胶回收试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）回收大约１．５ｋｂ的目的条带，连接到ｐＧＭ－Ｔ载体（北京索莱宝科技有限公司）上，转化至Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α感受态细胞中，将阳性重组子送北京擎科新业生物技术有限公司测序。将测定得到的１６ＳｒＤＮＡ序列通过ＢＬＡＳＴ软件与ＧｅｎＢａｎｋ中相关序列进行比对，并利用ＭＥＧＡ５．０软件进行聚类分析构建进化树。１．６不同温度对菌株Ｍ１生长的影响将Ｍ１菌株的菌液以１％的接种量接种于５ｍＬＬＢ培养基中，分别培养于１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５和６０℃系列摇床内，摇床转速为１００ｒ/ｍｉｎ，２ｄ后测定菌株的生长量。每个

5、处理重复３次。１．７不同ｐＨ对菌株Ｍ１生长的影响将Ｍ１菌株的菌液以１％的接种量分别接种于ｐＨ２．０、４．０、６．０和８．０的５ｍＬＬＢ培养基中，置于３０℃、１００ｒ／ｍｉｎ的摇床上培养，２ｄ后测定菌株的生长量。每个处理重复３次。２结果与分析２．１菌株分解纤维素能力鉴定腐熟发酵物样品经羧甲基纤维素钠培养基分离培养和ＬＢ培养基划线纯化培养后共得到５株形态不同的菌株，分别命名为Ｍ１－Ｍ５。５株菌都可以在羧甲基纤维素钠培养基上生长，具有降解纤维素的能力。同时测定菌株在刚果红纤维素琼脂培养基中生长时的ＨＣ值（Ｄ/ｄ），对筛选到的菌种进行分解纤维素能力的初步鉴定，结果如表１所示。

6、Ｍ１－Ｍ５菌株的ＨＣ值表明，Ｍ１菌株的ＨＣ值最高。前人研究表明［４］，ＨＣ值超过２．５０的菌株纤维素酶活性高，Ｍ１菌株的ＨＣ值为２．５０，具有较强的纤维素降解能力。２．２菌株鉴定结果将菌株Ｍ１的１６ＳｒＤＮＡ测序结果用ＢＬＡＳＴ软件进行同源性比较，菌株Ｍ１的系统发育树如图１所示。结果表明，Ｍ１菌株序列与多个假单胞菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．）菌株的１６ＳｒＤＮＡ序列相似性都达到９９％，与Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．ＪＣ５菌株处在同一个分支上，因此，将菌株Ｍ１归属于Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐ．。２．３Ｍ１菌株生长特性Ｍ１菌株生长特性如图２所示，由图２可知，菌株的温

7、度生长范围为１０～４５℃，最适生长温度在３０℃左右，当温度高于４５℃时，菌株几乎不能生长。ｐＨ６～８条件下菌株均可生长，最适条件为ｐＨ６，ｐＨ＜４或ｐＨ＞１０，菌株均不能生长。３小结与讨论本试验从腐熟堆肥发酵物中筛选到５株形态不同的菌株。分别命名为Ｍ１－Ｍ５。５株菌都可以在羧甲基纤维素钠培养基上生长，具有降解纤维素的能力。同时测定菌株在刚果红纤维素琼脂培养基中生长时的ＨＣ值，Ｍ１菌株的ＨＣ值最高（２．５０），具有较强的纤维素降解能力。对菌株Ｍ１进行分子鉴定，结果表明，Ｍ１菌株序列与多个假单胞菌属菌株的１６ＳｒＤＮＡ序列相似性都达到９９％，与Ｐｓｅｕｄ