刺五加内生细菌的分离及抑菌研究

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1、刺五加内生细菌的分离及抑菌研究从刺五加中分离出内生细菌227株，以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌为供试菌，分别对其液体发酵液进行了抗菌活性的研究。结果表明：刺五加内生细菌对3种供试菌有一定的抑菌活性。关键词：刺五加；内生菌；分离；抑菌中图分类号S567.239文献标志码BIsolationofEndophytefromEleutherococcussenticosusHarmsandItsAntibacterialActivityXiongYananLongYuehongeimeiZhangGuanglingZhuLihuaAbstract227st

2、rainsofendophyterootofEleutherococcussenticosusHarms,andtheantibacterialactivitiesoftheirfermentationbrothagainstE.coli,BacillussubtilisandStaphyloccocusaureusRosenbachshavecertainan－tibacterialactivityagainstthethreekindsofexperimentalbacteria.Keys；endophyte；isolation；antibacteria

3、lactivity刺五加（Eleutherococcussenticosus）是我国医药珍品[1]，历代本草医药记载，其有益气健脾、补肾安神之功效，为著名的滋补保健药品。随着近代中药工业的发展，给野生药用生物资源造成了巨大压力，野生刺五加资源破坏严重[2]；由于人工栽培难度较大，至今未形成大规模种植产业[3]。植物内生菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各组织和器官内部的真菌或细菌,被感染的宿主植物不表现出外在病症.目前国内外关于刺五加的研究主要集中在植物化学成分和栽培等方面，而内生菌的研究较少且集中在内生真菌，其内生细菌研究尚未见报道[

4、4-5]。笔者对刺五加内生细菌进行了分离，初步分类及其抑菌效果额研究，以期为探索刺五加与其内生细菌的关系奠定基础并进一步寻找新的活性成分。1材料与方法1.1材料1.1.1植物材料刺五加植株于2007年4~6月采自辽宁省本溪市、吉林省梅河口市、吉林省柳河县、黑龙江省穆陵市、河北省兴隆县（雾灵山）等5地区。1.1.2供试菌种供试指示菌菌种为大肠杆菌（Escherichiacoli），枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），金黄色葡萄球菌（Staphylocccusaureus），均购自中国医学微生物菌种保藏管理中心。1.1.3培养基NA（营养肉汤培养基

5、）：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH值7.2；NB（营养琼脂培养基）：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂2%，pH值7.2。1.2方法1.2.1刺五加内生细菌的分离纯化刺五加植株流水冲洗去土，按根、茎、根茎等部位进行分割，每段长10cm左右，按下列程序表面消毒：无菌水冲洗→95%乙醇漂洗1min→6%NaClO浸洗3min→75%乙醇漂洗0.5min→无菌水漂洗3次→无菌滤纸吸干。将上述处理过的材料韧皮部与木质部无菌分离，韧皮部切成约0.5cm×0.5cm的薄片，然后将薄片以直插入和水平贴附两种方式置于分离平板上，25~28℃暗

6、培养，待材料边缘有菌苔长出后，转接与纯化平板划线法分离纯化，镜检验纯后转接到斜面。　　对照实验以检查植株表面消毒是否彻底，将上述同样条件处理过的材料不作切割直接滚印于对照平板，并取最后一次漂洗用无菌水涂布于对照平板，至相同条件下培养。结果对照平板上无菌长出，表明所分离菌株属于植物内生细菌，而不是表面附生菌。1.2.2刺五加内生细菌的形态学鉴定从菌落特征、革兰氏染色特征、细胞形态特征等对分离菌株进行初步鉴定。1.2.3刺五加内生细菌的发酵将纯化后的单个菌落转接到装有30mLNA液体培养基的100mL锥形瓶中，在30℃，160r/min条件下振荡培养，作为种子培

7、养液。2d后，移取1mL的种子培养液接种到装有100mLPDA液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃，160r/min条件下进行发酵培养3d。1.2.4发酵液抑菌活性测定将高温灭菌后的滤纸片（R=8mm）在离心得到的发酵液中浸泡，取出晾干，然后再浸泡1次，取出晾干，以加大滤纸片上有效物质的浓度。将晾干的滤纸片放在涂有指示菌的培养基上，并且以无菌水和0.01mg/mL的氨苄青霉素做对照。生化培养箱中30℃培养2d，观察抑菌圈的有无以及测量抑菌圈的直径（抑菌圈直径=无菌圈直径-滤纸片直径）。2结果与分析2.1刺五加内生细菌的分离通过微生物学传统分离培养和划线稀释

8、分离方法从刺五加之中获得内生细菌227株。根据菌落特