rna干扰下调骨癌痛大鼠脊髓背角pkcγ表达镇痛效应的研究

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1、华中科技大学博士学位论文中文摘要RNA干扰下调骨癌痛大鼠脊髓背角PKCγ表达的镇痛效应研究博士研究生肖兴鹏博士生导师田玉科教授华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室研究背景癌性疼痛是晚期癌症患者最常见的症状之一，由于受到生理、情感、认知、行为和社会文化等因素的影响，因而具有很大的易变性和主观性。骨癌痛是一种性质剧烈、烧灼样且伴有严重负性情绪反应的疼痛，常伴有骨折和其他骨骼相关性疾病的发生，并最终导致患者生活质量的严重降低和死亡率的上升。目前对于骨癌痛的治疗已有多种治疗方法，如癌痛的三阶梯治疗方案、放疗、化疗以及手术等，但仍有很大一部分骨癌痛患者其疼痛程

2、度没能得到有效的缓解，同时这些传统的治疗方法往往也伴有大量的副作用，例如阿片类药物容易引起便秘、药物成瘾以及阿片类药物治疗过程中的认知功能障碍等；放疗及化疗过程中在抑制或杀伤癌细胞的同时，对机体内正常细胞也有毒害作用等等，因此极有必要寻求一种基于机制性的、力求能达到高效、作用持久、毒副作用小等优点的新的治疗方案。脊髓是外周伤害性信息传递及调控的初级中枢之一，尤其是脊髓Ⅱ层，在伤害性信息的传递、整合过程中发挥着重要的作用，观察它们在中枢部位的投射及其所含化学物质的变化，对于阐明伤害性信息的传递和调控机制，具有重要意义。大量的研究结果表明，脊髓背角组织中的蛋白激酶

3、Cγ（proteinkinaseCγ，PKCγ）不仅仅参与了脊髓水平伤害性信息的传递与调制，而且促进了脊髓敏化的形成和发展，在慢性疼痛的产生和/或维持中PKCγ可能发挥着重要的作用，因此若能有效降低PKCγ的表达，3华中科技大学博士学位论文或许能够获得良好的镇痛效果。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术是近几年发展起来的转录后基因沉默技术(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)，它利用小片段双链RNA(doubleshortRNA,dsRNA)即小干扰RNA（shortinterferingRNA,

4、siRNA），特异性降解相应序列的mRNA，从而高效、特异性的沉默相应基因的表达。RNAi作为一种细胞水平的基因敲除工具，业已成为研究内源性基因功能和信号转导途径的有效手段，但如何能持久有效地发挥其降解相应序列mRNA的作用，仍是此技术面临的最大障碍之一。慢病毒载体是常用的基因转移系统，具有能感染非分裂期细胞和分裂期细胞的特性，一旦病毒与细胞结合,病毒的基因则可整合到细胞的基因组中,成为基因遗传的稳定组成部分,从而可在细胞的分裂过程中传给子代，同时其致病基因已经剔除，重组野生困难，因而用慢病毒载体表达siRNA能安全持久地发挥下调目的基因表达的作用，可用于离体

5、实验和在体实验。基于以上理论基础，本研究拟通过以下四部分的研究，来评价siRNA干扰下调骨癌痛大鼠脊髓背角组织中PKCγ表达的镇痛效应：１：制作骨癌痛大鼠模型，观察PKCγ在骨癌痛大鼠脊髓背角组织中的表达变化及大鼠疼痛行为学的改变（包括机械缩爪阈值和机械缩爪持续时间），探讨PKCγ上调值与大鼠疼痛程度改变之间是否具有某种关系，以此初步探讨PKCγ在骨癌痛的产生和/或维持中是否发挥了一定的作用；2：在第一部分研究的基础上，将PKCγ特异性抑制剂GF109203X注入骨癌痛模型大鼠蛛网膜下腔，观察PKCγ功能被抑制后，骨癌痛大鼠疼痛程度是否显著减轻，从而推断PKC

6、γ在骨癌痛发病机制中的作用；3：根据大鼠PKCγ-mRNA序列，设计并构建3个大鼠PKCγ基因的shRNA慢病毒载体，并在体外鉴定其干扰效率，筛选出一个有效的干扰靶点，为下一步试验提供试验基础；4：将有效靶点的慢病毒载体注射到骨癌痛模型大鼠蛛网膜下腔，评价其镇痛效应，为慢性疼痛的转基因治疗和siRNA的在体试验提供理论基础。4华中科技大学博士学位论文研究方法与结果1.骨癌痛大鼠脊髓背角蛋白激酶Cγ表达的变化及意义方法:选取成年雌性Wistar大鼠64只，随机分为三组，正常对照组（Naïve组，n=16）：未作任何处理的健康大鼠；假手术组（Sham组，n=16）

7、：大鼠右侧胫骨上段骨髓腔注射热灭活的Walker256细胞10µl；骨癌痛模型组（Cancer–inducedbonepain，4CIBP组，n=32）：大鼠右侧胫骨上段骨髓腔注入Walker256细胞10µl(4×10cells)制作骨癌痛模型。模型制作前一天及术后21天内每隔3天观察各组大鼠疼痛行为学变化（包括机械缩爪阈值和机械缩爪持续时间），且各组大鼠分别在术前一天（-1d）及手术后第6、15、21天灌注后取脊髓L4~6节段组织(每个时点随机选择4只)，冰冻切片后作免疫组织化学DAB染色以检测脊髓背角组织中PKCγ的表达；同时对骨癌痛模型组大鼠于术前一天

8、及手术后第6、15、21天，各选4只大