转基因絮凝栅藻之构建及自絮凝生栅藻细胞絮凝研究

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1、转基因絮凝栅藻之构建及自絮凝生栅藻细胞絮凝研究1绪论1.1微藻的研究进展1.1.1微藻的概述微藻是指一类在显微镜下才能辨别形态的微小藻类的总称，其细胞微小、形态多样、生存环境广阔、适应性强，存在于包括海洋、陆地、大气在内的所有生态系统中。由于技术手段的不断发展，数以万计的微藻被筛选获得，根据需求的不同有针对性进行了开发利用，并构建了藻种的资源库。美国能源部的ASP计划分离获得了3000多种藻株，并对其中300多株生长速度快、脂肪含量高的绿藻、桂藻和蓝藻等藻种进行了实践性的规模化培养⑴。日本国际贸易和工业部的地球研究更新技术计划分离得到

2、10000多种微藻，其中不乏具有生长速度快、易高密度培养、耐高温、耐受高浓度C02等性状的优良藻种[2]。我国在微藻的选育方面也幵展了大量的研究工作，并蹄选得到66株富油富径微藻[3]。另外，通过人工诱变以及基因工程的手段，有针对性地对藻株的特定性状进行改造，进一步丰富了藻种资源。微藻的培养方式可以分为自养培养、异养培养和兼性异养培养三种。自养培养方式是当前微藻商业化生产的最主要培养系统。自养培养可以分为幵放式户外池塘和封闭式光生物反应器。开放式户外池塘可分为跑道式、圆池式和斜坡式；封闭式光生物反应器又可分为柱式、管式、板式以及一些其

3、他特殊类型。自养培养由于受到光照的限制，细胞密度一般较低（在0.5g/L左右）。因此，难以获得较高的生物量是自养培养的主要问题[7]。微藻的异养培养是指在培养基中提供微藻生长所必需的碳源和能源，利用传统的发酵装置进行培养，类似于微生物发酵，具有不需要光照，生长快，培养密度高等优点。利用酶解淀粉制备成葡萄糖水溶液进行异养培养小球藻，得到的藻细胞油脂含量可达干重的55%，远高于自养培养的15%。但有学者认为：将异养培养的微藻用于能源生产不仅不能固定C02,反而会排放出C02;而且外加有机碳源，还会增加培养成本，失去了自养培养的优点，微藻难

4、以和产油微生物在能源应用领域竞争[9]。兼性异养培养兼有自养和异养的双重特性，既能利用C02作为碳源，乂能利用有机碳作为碳源。在暗周期中，利用有机碳进行异养生长，减少生物量损失；而光周期中利用C02和光能进行自养生长，又可以减少有机碳的用量，因此具有相当的应用前景。国内学者利用兼性-异养培养的小球藻在碳链种类含量的变动趋势与异养培养雄本相同，但数值上小于异养培养对舟形藻兼性拜养培养的研究发现，有机碳源的不同将会影响二十碳五锦酸（EPA)的产量。1.2斜生栅藻的研究进展1.2.1斜生栅藻旳概述斜生栅藻具有良好的C02固定能力。Morai

5、s等[127]发现在3(rC，CO2浓度为18%的环境中，斜生栅藻的C02固定速率可达0.260g/L;110等[128]从台湾南部的淡水水体中分离获得7株斜生栅藻均表现出良好的C02固定能力，其中斜生栅藻andal等[129]也发现斜生栅藻具有耐受高浓度CO2的能力，耐受C02浓度最高可达80%。另外，斜生栅藻在减排二氧化碳的同时还能生产油脂。Ho等1128]先以营养成分充足的培养基来在C02浓度为10%的条件下培养斜生栅藻，再用营养缺陷型培养基培养促进脂类的积累，其生物量产率292.5mg/Ld、CO2的消耗速率为549.9mg/

6、Ld及脂类产率为78.73mg/Ld。Tang等1_研究了斜生栅藻SJTU-3在不同CO2浓度下的生长状态以及油脂积累情况，结果发现C02浓度为10%时栅藻生长最快，C02浓度在30%-50%范围内，最利于胞内多不饱和脂肪酸以及总脂的积累。2斜生栅藻的无菌培养2.1引言由于微藻具有重要的经济价值和应用价值，因此成为国内外研究的热点，大量的藻株被蹄选出来。然而在己分离鉴定的上万株微藻中，只有一小部分是纯培养藻种，难以获得无菌纯种微藻已成为影响微藻研究的重要因素。虽然从自然界釆集的藻细胞可以直接进行诸多研究，但由于藻细胞表面容易吸附细菌，

7、且在细胞内部可能会有细菌共生存在，为避免因细菌的存在而造成假阳性结果，对实验藻株进行无菌纯化必不可少目前，用于微藻无菌纯化的方法包括涂布划线法、离心洗漆法、稀释过滤法、福照法、化学消毒法、抗生素法等[2G7]。其中抗生素法是常用的除菌方法，将抗生素法与其他除菌方法结合对微藻进行无菌纯化效果更佳，如Su等采用溶菌酶/SDS结合抗生素法对玛塔亚历山大藻进行无菌化处理，得到了无菌藻株。本实验利用溶菌酶/SDS进行预处理，结合离心洗漆法、抗生素法及涂布划线法对斜生栅藻进行无菌处理，并考察温度、光照强度等培养条件对获得的无菌藻株生长的影响，寻找

8、最适宜两株无菌斜生栅藻生长的培养条件，为后续的研究工作提供可靠的实验材料和良好的生长环境。3斜生栅藻遗传转化体系的建立.........443.1引言.........443.2材料、仪器和试剂.........443.