藏酋猴类似人clock基因片段的克隆论文

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1、藏酋猴类似人clock基因片段的克隆论文李韦江舟王红星周亮关俊文刘延友汪宇辉王正荣【摘要】目的：在藏酋猴中，寻找和克隆与人clock基因类似的基因。方法：提取藏酋猴外周血白细胞RNA，逆转录为全基因组cDNA，利用人clock基因保守序列设计相关引物，克隆，测序，进行生物信息学分析。结果：扩增得到1994bp的核酸序列。该序列与人，苏门答腊猩猩.freel)是一种广泛存在于生物体内的节律现象，其周期在20～28小时之间，该节律是生物体内最强的生物节律。近日节律是当前研究最多以及物质基础相对研究得最清

2、楚的生物节律。该节律是内源性的，通常情况下，生物钟自激振荡，同时因机体生活在以昼夜交替的自然环境中，表现出以24小时为周期的特点。生物钟系统的结构基础为一系列具有正向或负向调节功能的钟基因及其产物，包括Clock、Per1、Per2、Per3、Bmal1、Cry1、Cry2、Timless等。在哺乳动物中，clock基因具有很高的同源性，在近日节律系统中起着中心作用2-5。到目前为止，猕猴的clock基因的研究尚未见报道。本实验将通过人等多种哺乳动物clock基因的保守序列设计PCR引物，试图在藏酋

3、猴寻找clock基因。1材料和方法1.1材料及试剂提取总RNA所用材料为取自四川省医学科学院动物实验所人工饲养藏酋猴静脉血液。TRIZOLReagent(Invitrogen公司);RevertAidTMFirstStandcDNASynthesisKit(Fermenta公司);TaqDNApolymerase(NEFirstStandcDNASynthesisKit操作手册和成cDNA第一链。从GenBank数据库中检索到人Homosapiens(BC041878)，褐家鼠Rattusnorve

4、gicus(NM_021856)，小鼠Musmusculus(NM_007715)，绵羊Ovisaries(NM_001130932)苏门答腊猩猩Pongoabelii(NM_001132234)等5种哺乳动物clock编码区全序列，比对序列，根据保守序列设计引物如下(由Invitrogen公司合成)：表1PrimerSequenceP1F5'AGAGTATCTAGAAACAAATCTGAAAAGAAACG3'P1R5'CTTTATGTTTTCGTAAAAAATCAATGC3'P2F5

5、'GGCACAGTCAGCAAACAT3'P2R5'CTGCCTGTCCTGAGTGAA3'分别以P1F，P1R和P2F，P2R为引物，合成的第一链cDNA为模板做PCR。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。目的扩增产物割胶纯化(E.Z.N.A.GelExtractionKit)后与载体连接(pBST克隆试剂盒)并转化感受态细胞，涂验证平板，随机挑取阳性克隆提取质粒，进行序列测定(由Invitrogen公司完成)。根据测序结果和之前比对的6种哺乳动物clock编码区保守序列，

6、设计引物如下：表2PrimerSequenceP1F5'AGAGTATCTAGAAACAAATCTGAAAAGAAACG3'P3R5'AACATGATTTGCCTTTCCCATATTG3'P4F5'ATGCAATATGGGAAAGGCAAATC3'P4R5'ATCTTATCTGCCTGTCCTGAGTGAA3'再重复之前PCR及目的产物测序方法，得到分别以P1F，P3R和P4F，P4R为引物的目的PCR产物序列。1.2.2序列分析采用DNAMANVersion5对所克

7、隆的四条片段基因序列进行比对，根据相同序列进行拼接得到一条长序列，并对基因序列和氨基酸序列进行同源性比较。用ORFfinder(.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)进行ORF查找。2结果2.1PCR产物以合成的第一链cDNA为模板，P1F，P1R;P2F，P2R;P1F，P3R;P4F，P4R4组引物分别做PCR。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，见图1。分别进行基因克隆和测序。图1RTPCR扩增基因cDNA片段2.2测序结果测序得到4条片段大小

8、分别为：F1(引物：P1F，P1R)106bp，F2(引物：P2F，P2R)175bp，F3(引物：P1F，P3R)905bp，F4(引物：P4F，P4R)1106bp。通过重叠相同序列部分拼接出一条1994bp的基因序列pmClock，ORFFinder搜索开放阅读框，该核酸序列可编码一条含664个氨基酸的氨基酸序列。2.3基因序列及氨基酸序列比较所得到的基因片段核酸序列与人clock基因编码区序列(GenBank：BC041878)比较，同源性为9