pafah基因多态性与1型糖尿病的相关性论文

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1、PAFAH基因多态性与1型糖尿病的相关性论文【摘要】目的探讨血小板活化因子乙酰水解酶（PAFAH）基因G994T和G275A多态性及血浆PAFAH水平与1型糖尿病的相关性。方法选择115例1型糖尿病病人(T1DM组)和106例正常对照者（CON组）作为研究对象,采用PCRRFLP和特异性引物方法测定PAFAH基因G994T和G275A多态性，采用酶水解底物显色法测定血浆PAFAH水平。结果T1DM组G275A位点GA基因型频率显著高于CON组（χ2=4.667，P0.05）,A等位基因频率两组差异无显著性（χ2=1.976

2、，P0.05）。TIDM组G994T位点T等位基因频率和GT基因型频率与CON组比较差异无显著性(χ2=0.148、0.072,P0.05)。与CON组相比，T1DM组PAFAH活性均明显降低（P=0.00003）。结论PAFAH基因275G→A的点突变可能与1型糖尿病相关。【关键词】1烷基2乙酰甘油磷酸胆碱酯酶糖尿病1型基因型［ABSTRACT］ObjectiveTostudytherelationshipbetorphismofPAFAHgene,plasmaPAFAHlevelandtype1diabetesme

3、llitus(T1DM).MethodsThisstudyconsistedof115patientsermethod.ActivityofplasmaPAFAHinallpatientsandcontrolsinedbyPAFAHAssaykit.ResultsThefrequenciesofGAgenotypeonG275Apolymorphism(χ2=1.976,P0.05).ThefrequenciesofTalleleandGTgenotypeonG994TpolymorphismbetaPAFAHinT1DMut

4、ationofPAFAHgenemayberelatedtotype1diabebesmellitus.［KEYSO0.5μL,2.5μmol/L上下游引物各1μL;2.5×106U/LTaqDNA聚合酶0.3μL,基因组DNA模板1μL(25ng)；加双蒸水补充至20μL。PCR反应条件：94℃预变性5min,然后94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸30s，循环35次后72℃末次延伸10min。在总体积15μL酶切反应体系中加入PCR产物8μL,BclⅠ酶5U,55℃消化1h。取酶切产物10μL上样于30g/L的琼脂糖

5、凝胶电泳，于紫外线灯下观察结果并拍照，记录基因型。野生型282bp的PCR产物中不存在BclⅠ的识别序列，故酶切后只有一条282bpDNA片段者为野生型（GG纯合型）。但G→A突变后的个体存在TGATCA识别序列，可以被BclⅠ切开，故有282、113、169bp等3条带者为突变杂合子（GA杂合型）。随机选择酶切证实野生型和杂合突变型标本PCR产物各两份测序证实酶切结果。②G994T位点：引物序列为上游A5′CTATAATTTATATCATGCTT3′，下游B5′TTTACTATTCTCTTGCTTTAG3′，下游C5′

6、CTATAATTTATATCATGCTT3′,下游D5′TCACTAAGAGTCTGAATAAC3′。AB引物扩增片段的长度为160bp，AC、AD引物扩增片段长度均为108bp。反应体系：总体积为20μL，内含10×PCR缓冲液2μL,10mmol/LdNTP0.5μL,2.5μmol/L上下游引物各1μL;2.5×106U/uLTaqDNA聚合酶0.3μL,基因组DNA模板1μL(25ng)；加入双蒸馏水补充至20μL。PCR扩增反应条件：采用Touchdoin；94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s，循

7、环5次；94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸10min。每一样本针对不同的特异性引物作3个PCR反应，其中引物A和B特异性扩增G994T位点所在的第9外显子的全长，引物A和C扩增野生型目的片段，引物A和D扩增突变型目的片段。只在野生型泳道108bp部位出现电泳条带的基因型为野生型纯合子GG;同时在野生型泳道108bp和突变型泳道108bp部位出现电泳条带的基因型为突变杂合子（GT杂合型）。随机选择部分野生型和突变型个体的第9外显子PCR产物测序，证实分型结果。1.2.3PAFAH活性测定

8、采用酶水解底物显色法，按试剂盒说明操作,试剂盒购自美国CaymanChemical公司。1.3统计学处理采用SPSS11.5软件进行数据处理,计量资料用±s表示，数据间比较采用t检验；计数资料比较用χ2检验。2结果2.1两组血浆PAF