转录组测序技术

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1、1请输入课题讲师：转录组测序技术莫小贝2014-4-11第一讲第二讲第三讲........目录RNA-Seq技术背景RNA-Seq技术应用领域RNA-Seq技术原理RNA-Seq技术优势RNA-Seq技术面临的挑战及发展2014-4-12第一节RNA-Seq技术背景RNA-Seq又称转录组高通量测序（transcriptomesequencing）或称为全转录组鸟枪法测序（WholeTranscriptomShotgunSequencingWTSS）2014-4-13RNA-Seq技术背景2014-4-1原则上，所有的高通量测序技术都能进行RNA测序，自

2、2005年以来，Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序技术相继诞生，之后HelicosBiosicences公司有推出单分子测序（Singlemoleculesequencing,SMS）技术。新一代测序技术又称作深度测序或高通量测序，是相对于传统的Sanger测序而言，主要特点是测序高通量，测序时间和成本显著下降。各平台测序原理及序列长度的差异决定了各种高通量测序仪具有不同的应用侧重。罗氏公司鲁米那公司高通量测序法原理美国应用生物系统公司寡聚物连接检测测序赫利公司4RNA-Seq

3、技术背景2014-4-1广义：指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA。转录组（transcriptome）狭义：指所有mRNA的集合。52014-4-1RNA-Seq技术背景转录组测序技术：是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。62014-4-1RNA-Seq技术背景高通量测序技术（High-throughputsequencing）是指能够一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序，每一次序列测定的读长一般较短的测

4、序技术。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万几百万条DNA分子进行序列测序，因此在有些文献中称其为下一代测序技术（nextgenerationsequencing）组件其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（deepsequencing）72014-4-1RNA-Seq技术背景有关于ncRNA的一些知识非编码RNA（ncRNA）主要包括：转运RNA（tRNA），核糖体RNA(rRNA)，小核RNA（snRNA），核仁小分子RNA（snoRNA），细胞质小分子RNA（

5、scRNA），不均一核RNA（hnRNA）及小RNA（microRNA,miRNA）等。功能：非编码RNA具有调节基因表达的作用，如对染色体结构、RNA加工修饰及稳定性、转录和翻译及一些蛋白质稳定性的影响。8第二节RNA-Seq技术原理2014-4-1把高通量测序技术应用到有mRNA逆转录生成的cDNA上，从而获得来自不同基因的mRNA片段在特定样本中的含量，这就是mRNA片段或mRNA-Seq，同原理，各种类型的转录本都可以用深度测序技术进行高通量检测，统称作RNA-Seq。92014-4-1RNA-Seq实验流程图102014-4-1RNA-Seq实

6、验步骤112014-4-1RNA-Seq测序数据的分析122014-4-1RNA-Seq提供试验报告原始数据报告（Fasta-Q格式），包含所有测序序列信息，碱基读取质量评估基本数据分析报告（Excel表格），包含有效序列的序列信息、与参考基因组比对后的注释信息等。高级数据分析（应客户要求定制），如基因覆盖率和测序深度分析，基因表达差异分析，基因结构分析，鉴定选择性剪切现象，发现新基因，鉴定基因融合现象。13第三节2014-4-1RNA-Seq技术应用领域14第四节2014-4-1RNA-Seq技术优势*数字化信号：直接测定每个转录本片段序列，单核苷酸分

7、辨率的精确度，同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。*高灵敏度：能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。*任意物种的全基因组分析：无需预先设计特异性探针，因此无需了解物种基因信息，能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因，发现新的转录本，并精确地识别可变剪切位点及cSNP，UTR区域。*更广的检测范围：高于6个数量级的动态检测范围，能够同时鉴定和定量稀有转录本和正常转录本。15第五节2014-4-1RNA-Seq技术面临的挑战及发展RNA-Seq的发展前景虽然RNA-Seq的技术还面临着种种困难，但作为一个刚

8、刚起步的新技术RNA-Seq出其他转录组学技术无可比拟的优势：既能提供单碱基分辨