川芎嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响论文

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1、川芎嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响论文【摘要】目的探讨川芎嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤时细胞凋亡的影响及可能的机制。方法雄性SD大鼠36只随机分三组：假手术组、模型组、川芎嗪治疗组，每组12只。用结扎大鼠左冠状动脉前降支法制备心肌缺血再灌注模型，测定再灌注前静脉注入川芎嗪对损伤大鼠心肌组织中MDA,SOD生成的影响；免疫组化法检测大鼠心肌细胞Bcl-2、Bax基因表达。结果①川芎嗪组能减少心肌组织中MDA生成，并明显提高缺血再灌注组织中SOD的活力；②川芎嗪组中bcl-2表达明显增多，平均灰度值明显下降，与模型组比较有显著差异（P0.01），bax表达下降，但无

2、统计学意义（P0.05）。结论川芎嗪可能通过拮抗氧自由基、上调凋亡抑制基因bcl-2等作用.freell，相当于原生药40mg）；免疫组化染色试剂盒（购自武汉博士得生物工程有限公司）。1．3心肌缺血再灌注损伤模型的建立各组动物术前禁食24h，20%乌拉坦（1g/kg）腹腔麻醉，气管插管，连呼吸机，机械通气；描记肢导心电图；胸骨左缘2mm处开胸，剪开心包，暴露冠脉，在左前降支起点后0.5cm穿一丝线，垫一硅胶管，血压稳定时结扎，关闭胸腔。45min后经尾静脉注入治疗药物及溶液，川芎嗪治疗组按50mg/kg（按人和动物体重比例计算，为临床剂量的5倍）的剂量给药，用生理盐水稀

3、释到2.0ml，再灌注前静脉注入，其余两组以等量生理盐水注入。之后打开胸腔，剪去结扎线，假手术组置线后不予结扎，冠脉断流及再通与否依心电图ST段抬高及恢复为准。再灌注1h后，取部分左室心肌立即放入中性福尔马林溶液中固定12~20h后送病理室，制成蜡块标本，连续切片，其中5张严格按免疫组化方法进行染色，DAB显色，光镜下观察bcl-2、bax的表达情况；再取部分左室标本放入储存管中，移入-70℃冰箱中留做SOD、MDA的检测。1．4检测指标1．4．1心肌组织中SOD、MDA含量的测定制作心肌组织匀浆，将10%的匀浆用低温低速离心机3000r/min左右离心10min，留上

4、清，然后按试剂盒要求测定SOD、MDA含量。1．4．2bcl-2、bax的表达用免疫组化方法分析，切片厚4μm，常规脱蜡水化，一抗为兔抗大鼠Bax或Bcl-2单克隆抗体(1：50稀释)，二抗为生物素化羊抗兔IgG(1：100稀释)，以PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色，光镜观察阳性信号。胞质染成棕黄色的为阳性细胞。病理图文彩色分析仪进行半定量分析，高倍镜下（×400）下每组选取10个视野，对视野内免疫组化阳性信号进行图象分析计算平均灰度值，以相应的均值分别代表每张标本染色的深浅，最后以每组均值进行比较。平均灰度值与bcl-2、bax的阳性表达程度成反变关系。1．5实验

5、数据计算及统计学分析采用SPSS12.0统计软件，所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析与q检验,以P0.05为差异有显著性。2结果2.1心肌组织中SOD、MDA含量的测定如表1所示，模型组MDA含量明显高于假手术组，SOD的活力显著降低，与假手术组比较有显著差异(P0.01)。与模型组比较，川芎嗪治疗组能减少心肌中MDA的生成，有统计学意义（P0.05）；能明显提高再灌注组织中SOD的活力，差异非常显著(P0.01)。2.2各组大鼠心肌组织bax和bcl-2基因蛋白表达及图像分析免疫组化结果显示，假手术组中bcl-2和bax均有轻度表达；模型组中b

6、cl-2表达减少，其平均灰度值增加，与假手术组比较，差异有显著性（P0.01)川芎嗪组中bcl-2表达明显增多，其平均灰度值明显下降，与模型组比较，差异非常显著(P0.01)，bax表达下降，其平均灰度值增加，但无显著性差异（P0.05）。见表2。3讨论近年来的研究表明，心肌缺血再灌注损伤的一个重要表现是心肌细胞的凋亡［2］。心肌缺血再灌注损伤过程中产生大量氧自由基，自由基可能通过以下途径诱发细胞发生凋亡:①作用于细胞膜，引起膜发生脂质过氧化，从而影响细胞信号转导系统；②直接损伤DNA，诱发细胞凋亡；③影响核基因转导，改变细胞的表型特征，诱发细胞凋亡；④攻击蛋白质，使具

7、有酶活性的蛋白质活性丧失或减弱。川芎嗪是从中药川芎的生物碱中分离得到有效单体，有改善微循环，扩冠脉，抗血小板聚集及抗血栓等多种作用，近年被广泛的应用于心脑血管疾病的治疗，尤其在心肌缺血再灌注损伤方面，已取得肯定疗效。实验证明［3］，川芎嗪能减轻氧自由基损伤，使抗氧化作用增强。本实验结果显示，大鼠心肌缺血再灌注后，心肌中的SOD活性降低，MDA大量生成同时心肌细胞发生凋亡。川芎嗪治疗组可以明显提高心肌组织中SOD的活力，降低MDA的生成量，从而表现出减轻缺血再灌注导致的损伤乃至心肌细胞的凋亡。其机制可能是通过激活抗氧化酶，提高SOD活性，清