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1、川芎嗪对青霉素致痫大鼠神经细胞凋亡的影响论文【摘要】目的：探讨川芎嗪(TMP)对青霉素致痫大鼠大脑神经元内核转录因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白表达及神经细胞凋亡的影响。方法：使用青霉素致痫大鼠模型,采用BL-410生物机能实验系统记录双侧大脑皮层痫样放电,待癫痫样放电稳定后,腹腔注射TMP,待其抑制作用最明显时,取大脑切片,观察大脑神经元内NF-κBp65蛋白表达的变化。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对NF-κBp65蛋白的表达进行定量分析，并用SPSS11.
2、5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK(q)检验。结果：TMP组大脑神经元内NF-κBp65蛋白表达的平均光密度及阳性面积率显著低于模型组,差异有显著性(P0.01)。结论：TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元有重要的保护作用。【关键词】川芎嗪癫痫放电神经元青霉素NF-κBp65癫痫是以大脑神经细胞群反复超同步放电引起的发作性、突然性、短暂性脑功能紊乱为特征,以反复痫样发作为表现的临床征候群,其发病机制尚未完全阐明。癫痫致脑损伤已被许多动物实验和临床观察
3、所证实,神经细胞凋亡是最近发现的癫痫脑损伤又一途径,虽出现较晚,但却能持续存在。川芎嗪,.freelethylpyrazine,TMP)。TMP可抑制海马神经元的放电活动,TMP可明显抑制吗啡依赖大鼠戒断症状及体重下降［1］,大剂量TMP对缺血、缺氧性脑损伤、海马CA1神经元的缺血性损伤有改善或保护作用［2，3］。TMP已被广泛应用于心、脑血管闭塞性疾病［4］的治疗。NF-κB广泛存在于真核生物中,是一个由复杂的多肽亚单位组成的蛋白家族。它作为信号传导途径中的枢纽,与免疫、肿瘤的发生发展、细胞凋
4、亡的调节以及胚胎发育等重要事件有着密切联系,是一种重要的核转录因子。目前,对NF-κB的研究已成为一个非常引人关注的领域［5］。本课题采用免疫组织化学方法、图像分析技术检测了TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元内NF-κBp65蛋白的表达及平均光密度及阳性面积率的变化影响,进一步探讨TMP对青霉素致痫大鼠大脑神经元作用的机制。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物SD大鼠(由武汉大学医学院实验动物中心提供),雌雄不拘,体重200～250g。1.1.2实验药品及试剂盐酸川芎嗪注射液(批号010700
5、1),常州制药厂生产；注射用青霉素钠(批号00109306),华北制药股份有限公司生产。1.1.3实验仪器BL-410生物机能实验系统,成都泰盟电子有限公司生产；江湾I-C型立体定向器,第二军医大学器材处生产。1.2方法1.2.1癫痫动物模型实验选用健康SD大鼠,用10%乌拉坦以10ml·kg-1体重腹腔注射(ip)麻醉,将动物固定在江湾I-2C型立体定向器上,于大脑左、右两侧前卤后3mm,矢状缝旁开3mm行开颅手术,暴露大脑皮层记录区域(2mm×2mm),将银球电极置于左、右两侧的记录部位,信
6、号输入置BL-410生物机能实验系统,进行左、右两侧脑电记录。用浸有青霉素溶液的明胶海绵(200u/mm3)置于左侧大脑皮层表面,诱发大鼠大脑皮层癫痫样放电,待癫痫放电稳定后,移去明胶海绵,用浸有温热生理盐水棉球盖住创口。1.2.2试验分组及取材将实验大鼠随机分为3组,每组10只:①A组(对照组),麻醉开颅手术1h后取大脑;②B组(模型组),青霉素诱发癫痫1h后取大脑；③C组(TMP组),青霉素诱发癫痫放电稳定后,再腹腔注射TMP(20mg·kg-1),待抑制作用最明显时取大脑。1.2.3HE染
7、色常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(厚约4μm)及HE染色。1.2.4免疫组织化学S-P法检测NF-κBp65蛋白相关抗原主要步骤：①组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；②3%过氧化氢，37℃孵育10min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；③Bcl-2采用微波抗原修复（3档，10min）.freelin；④正常羊血清37℃孵育10min以减少非特异性反应；⑤一抗37℃孵育1h，PBS洗4×5min；⑥生物素标记的二抗，37℃孵育10min，PBS洗4×5min；⑦链霉菌抗生物
8、素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10min，PBS洗4×5min；⑧DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；⑨苏木精复染，脱水，透明，封片。用PBS代替一抗作为阴性对照组，人扁桃体作为NF-κBp65的阳性对照组。1.3免疫组织化学结果判断NF-κBp65相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照组除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对NF-κBp65蛋白的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完
