迟缓爱德华氏菌对牙鲆免疫器官的影响

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研究报告REPORTS迟缓爱德华氏菌对牙鲆免疫器官的影响刘云姜明姜国良杨栋张士璀(青岛海洋大学266003)提要当经口腔灌注大量迟缓爱德华氏菌后,牙鲆的头肾和脾脏内的免疫细胞活性增强,表现为单核细胞数量增加,颗粒细胞内产生大量的颗粒以及颗粒吞噬作用的增强。研究结果还表明,病菌也会对免疫器官产生损害,可造成细胞水肿,膜性结构破坏及细胞坏死。本文详细观察了牙鲆肾、脾、肝、肠及血液的显微结构和肾、脾、肝的超微结构的变化,研究结果对疫苗的应用提供了良好的细胞学基础。关键词迟缓爱德华氏菌,牙鲆,免疫器官随着鱼类人工养殖规模的不断扩大,鱼类病害也人工养殖牙鲆的危害较重的三大疾病之一[1]。据李亚逐渐增多。据PlumbJ.A.1994年报道,迟缓爱德华氏南等1995年报道,由于鱼病的产生是鱼体本身免疫菌病(Edwardsiellatarda)是流行于淡水和海水鱼类的机能受抑制的结果,因此研究病菌与鱼体免疫之间的一种常见细菌病。有关鳗鲡的迟缓爱德华氏菌病病原关系、疫苗与鱼体免疫之间的关系极具理论和应用价学和组织病理学研究已见郭琼林等1995年,韩先朴等1995年的报道,而海水鱼类牙鲆的迟缓爱德华氏 国家重点基础研究发展规划(973)项目课题G1999012006菌病是由Yasunaga等于1982年首次报道,主要表现号;国家海洋863项目8190206号。为腹水,肝、肾出血、肥大,现在这种病已经成为海水收稿日期:20000628;修回日期:20000718STUDIESONTHEMORPHOLOGICALCHARACTERISTICS ANDTHEECOLOGYOFLateolabraxjaponicusLARVAL, JUVENILEFISHZHUJunquanLIMingyunSHAOQuanliJIADingwu(DepartmentofFisheries,NingboUniversity,315211)Received:Feb.28,2000KeyWords:Lateolabraxjaponicus,Larvaejuvenilefish,Morphology,EcologyAbstractThepresentpaperdealswiththelarvalandjuvenilefishofLateolabraxjaponicus.Themorphologicalcharacteristics andtheecologicalhabitswereobservedundertheconditionofartificialseedbreedingintheprocessofitslarvalandjuvenile fishdevelopment.Theresultsshowthat,aboutninthdaysafterhatching,theyolksacdisappeared.Aboutthi rtysixthdays afterhatching,medianfinraysweredifferentiated.Aboutfiftysixthdaysafterhatching,thescalesweveformed.Abouteightyfifthdaysafterhatching,thebodywascoveredcompletelybyscales.Withthedevelopmentofitsmorphology,itsecologicalhabitswerealsochangedaccordingly.(本文编辑:刘珊珊)42海洋科学/2000年/第24卷/第12期 研究报告REPORTS值,然而这方面的报道尚不多。作者利用光学显微与体;血球囊增宽;肾小管特别是近曲小管上皮细胞坏电子显微镜技术研究了迟缓爱德华氏菌对牙鲆死,细胞间隙不清,细胞质内出现空泡,肾小管与周围(Paralichthysolivaceus)免疫器官的影响和病理学变间质组织分离,有的已经完全解体成碎片,夹杂于间化,并将研究结果报告如下。质组织之中(图12)。1材料和方法2.2.2脾脾的脾索呈现萎缩的条索状,脾髓内充满了红细胞,白髓萎缩(图13)。1.1试验鱼2.2.3肝牙鲆的肝实质组织变化明显。正常牙鲆幼鱼购于山东威海海珍品养殖公司,平均的肝组织肝板清晰,肝细胞多角形,排列紧密(图体长15cm,每次购得的幼鱼都置于9L水族箱暂养 14)。感染后,肝组织以中央静脉为中心呈灶性病变,1周左右,换水,水温控制在211,充氧并用颗粒 细胞索间隙增大,肝窦中枯否氏细胞增多(图15),血饵料饲喂。正式实验时停止饲喂。 管亦发生扩张和空泡化。1.2迟缓爱德华氏菌2.2.4肠肠的变化不大,只是表现在肠黏膜迟缓爱德华氏菌来自天津动植物所。将迟缓爱上的黏液细胞膨胀(图16),除此之外,未见异常。德华氏菌活化、复壮、分离转接淡水的2216E斜面, 2.2.5血液感染后,血液中的白细胞数量上25~27培养48h后,用无颗粒生理盐水洗下菌苔,变化较大,淋巴细胞由67.6%降低到53.2%,而单核配成5.5108CUF/ml悬液,口灌0.1ml,24h后取 细胞的数量却从21.2%增加到38.2%,T检验差异材,同时设置对照组。显著(P<0.001),颗粒细胞的数量变化不显著。从腹水明显的病鱼中分离病菌,进行特征鉴定检2.3主要免疫器官的超微结构变化验,同时在-20冷冻干燥保存。2.3.1头肾头肾内细胞变化主要表现为(1)光镜样品取材包括肾、肝、脾和肠等器官组织,用 单核细胞的细胞质空泡化(图17);(2)颗粒细胞的小Bouin氏液固定、脱水、石蜡包埋,切片7m,Harris苏 型颗粒异常增多,大型颗粒由单位膜包围,内质不均木精曙红(H.E)染色;同时取血液样品,空气干燥, 匀,有的有内含物,有的已经空泡化(图18、19);(3)瑞氏染色,欧林巴斯显微镜观察摄影;电镜样品取头 颗粒细胞的细胞核异质化降低,核膜部分溶解(图肾、脾和肝切成0.5mm3小块,用2.5%戊二醛预固定 18、19);(4)髓样体颗粒增多(图110)。和1%锇酸后固定,梯度乙醇脱水,Epon812包埋, 2.3.2脾红细胞的核膜肿胀,颗粒细胞溶解,LKB超薄切片机切片,醋酸铀柠檬酸铅双重染色, 大量颗粒散在间质之中(图21);巨噬细胞细胞质内日立-7000型透射电镜观察及摄影。空泡化并有吞噬红细胞的现象(图22);部分颗粒细2结果胞的细胞核的染色质在核浆内散乱分布;核膜部分溶解,有的整个核裂解(图23)。线粒体数量减少,内嵴2.1病原菌的特征肿大,局部断裂、空泡化;内质网变形,膜上颗粒脱落,革兰氏阴性杆菌,菌体直、单个。25~28培养严重时会膨胀成泡状。24h菌体(0.6~0.8)m(0.8~2.4)m,多数为 颗粒细胞的颗粒变化更加多样化:有包裹细胞碎(0.7~0.8)m(1.1~1.4)m,随培养时间延长 片的电子密度极高的大型颗粒(图21,23),有在均质菌体缩短。长时间培养菌体会有很多呈球形。具有周颗粒内具有较高电子密度芯的中型颗粒,有无单位膜鞭毛,可运动,无荚膜,无芽孢。在普通培养基上25~ 包围的低密度小型颗粒(图24),大量细小颗粒(图28培养48h菌落直径为0.5mm左右。正圆形灰白 23)以及空泡化的颗粒(图24)。色透明隆起,周缘光滑。能在SS培养基上生长。 2.3.3肝肝细胞间分界不清晰,只在肝细胞2.2主要免疫器官及组织的显微结构的变化与肝细胞间接近血窦处,可见到桥粒结构,肝细胞的 2.2.1肾牙鲆的肾由头肾和中肾组成,头细胞核多数表现为染色质散乱,有空泡,核仁消失,部肾为淋巴样组织,中肾为泌尿组织,感染迟缓爱德华分核膜溶解、变形;肝细胞质内有多个灶性坏死病灶,氏菌后,肾间质内的造血组织明显增多,肾间质呈现大量线粒体肿胀成圆形,内嵴变形、溶解以至消失,严条索状(图11);肾小体血管球充血、变形,甚至解重者整个线粒体呈空泡化(图25);脂滴较多,部分内MarineSciences/Vol.24,No.12/200043 研究报告REPORTS图1迟缓爱德华氏菌对牙鲆免疫器官的影响11感染后牙鲆的头肾250;12感染后牙鲆的中肾,示血管球变形,血球囊增宽,近曲小管解体125;13感染后牙鲆的脾,示红髓和白髓250;14正常牙鲆的肝500;15感染后牙鲆的肝,示静脉扩张,肝细胞索状分布250;16感染后牙鲆的肠,示膨胀的黏液细胞 250;17感染后的头肾内的单核细胞,示空泡22000;18感染后的头肾内的颗粒细胞,示细胞核部分溶解,小型颗粒增多,大型颗粒空泡化9900;19感染后头肾内的颗粒细胞,示细胞核膜溶解,颗粒不均匀9900;110感染后的头肾内的颗粒细胞,示髓样颗粒13400。Fig.1EffectofinjectionofEdwardsiellatardaontheimmuneorganofBastardhalibut(Paralichthysolivaceus)11TheheadkidneyofParalichthysolivaceusafterinfection250;12ThekidneyofParalichthysolivaceusafterinfection,showingglomusdeformed,vascularsacenlargedandproximalconvolutedtubuledissolved125;13ThespleenofP.olivaceusafterinfection,showingredpulpandwhitepulp250; 14ThenormalliverofP.olivaceus500;15TheliverofP.olivaceusafterinfection,showingveinenlarged,livercellsdistributedinstrip250;16 ThegutofP.olivaceusafterinfection,showingswollenmucousgland250;17TheheadkidneyofP.olivaceusafterinfection,showingvesicularmono cytes22000;18TheheadkidneyofP.olivaceusafterinfection,showinggranulocytes!nucleusdissolvedpartially,smallgranuleincreasedandlarge vesiculargranule9900;19TheheadkidneyofP.olivaceusafterinfection,showinggranulocytes!nuclearmembranedissolvedandunevengranules 9900;110TheheadkidneyofP.olivaceusafterinfection,showingmarrowlikegranulocytes1340044海洋科学/2000年/第24卷/第12期 研究报告REPORTS图2迟缓爱德华氏菌对牙鲆免疫器官的影响21感染后的脾,示红细胞和颗粒细胞5500;22感染后的脾,示巨噬细胞吞噬红细胞6600;23感染后牙鲆的脾,示细胞核溶解,线粒体肿大7700;24感染后牙鲆的脾,示空泡化颗粒及密度较高颗粒8800;25感染后牙鲆的肝3300;26感染后牙鲆的肝,示包含絮状物的次级溶酶体9900;27感染后牙鲆的肝血窦,示断裂的指状微绒毛、髓样小体及桥粒7700;28感染后牙鲆的肝血窦内的免疫细胞,示淋巴细胞和颗粒细胞5500。Fig.2EffectofinjectionofEdwardsiellatardaontheimmuneorganofBastardhalibut(Paralichthysolivaceus)21ThespleenofParalichthysolivaceusafterinfection,showingerythrocytesandgranulocytes5500;22ThespleenofP.olivaceusafterinfection,showingmacrophagewasswallowingerythrocyte6600;23ThespleenofP.olivaceusafterinfection,showingnucleusdissolvedandmitochondriaswollen7700;24ThespleenofP.olivaceusafterinfection,showingvesiculargranulesandhighdensitygranules8800;25TheliverofP.olivaceusafterinfection3300;26TheliverofP.olivaceusafterinfection,showingwaddinglikesecondarylysosome9900;27TheliverhepaticsinusoidofP.olivaceusafterinfection,showingbrokenfingerlikevillus,marrowlikelittlebodyanddesmosome7700;28TheliverhepaticsinusoidofP.olivaceusafterinfection,showinglymphocytesandgranulocytes5500 MarineSciences/Vol.24,No.12/200045 研究报告REPORTS质网扩张,膨胀成小的空泡;溶酶体极度膨胀成大圆体。但是,病原菌在刺激鱼体防御机能功能增强的同形,包含颗粒内含物或絮状物,次级溶酶体增多(图时,免疫功能受到了抑制,如血液中的淋巴细胞数量26);肝脏中肝细胞的基浆电子密度变淡。肝血窦的急剧下降;免疫器官实质结构也在改变,主要表现为内皮细胞消失,肝细胞指状微绒毛缩短、断裂,部分溶肾间质及脾索呈现条索状,细胞间隙扩大和部分细胞解;有的血窦中还可以见到髓样小体(图27)。解体等;同时,超微结构研究的结果也显示,头肾、脾肝血窦内的免疫细胞也有变化:淋巴细胞、单核脏和肝脏内的单核细胞的细胞质空泡化;颗粒细胞的细胞的内嵴断裂,线粒体肿胀成圆形,严重者已经空核膜部分溶解,所有免疫细胞内大量线粒体已经肿泡化;颗粒细胞内的线粒体嵴断裂、膨胀,内质网溶胀,内嵴变形或溶解等,部分内质网扩张,膨胀成小的解,核糖体脱落且部分游离核糖体消失,颗粒细胞均空泡;溶酶体极度膨胀成大圆形,内质网、溶酶体和指质,有少数颗粒内有极细颗粒内含物(图28)。状微绒毛等断裂、水肿或溶解等,因而许多正常的生3讨论化反应不能进行,血液病理学研究的结果如血清总蛋白、胆固醇含量降低以及谷丙转氨酶、谷草转氨酶活鱼类在抵抗病原菌的侵袭时,机体自身存在着力的增强等也证明了这一点(另文)。所以,当口灌0.1非特异性防御系统和特异性防御系统。据安得森, ml迟缓爱德华氏菌24h后,病原菌在鱼体内不断增D.P.1984年报道,一旦病原菌侵入鱼体,就会出现3 殖并侵入鱼体肾和肝等部位,从而影响肝、肾行使正种结果,一是病原菌不断增殖,鱼死亡;二是鱼体的防 常功能,最终导致鱼病的发生,本项研究结果与御机能消除了病原菌;三是病原菌和鱼体之间保持平 Rashid,M.M.等[1]所做病原入侵的组织定位结果相衡,成为带菌状态。据HariSuprapto等1995年报道,迟 印证。根据以上结果作者进一步推测,迟缓爱德华氏缓爱德华氏菌细胞外产物及菌体成分均含有毒素,牙 菌的致病原将导致对鱼类免疫器官的损害,而其免疫鲆迟缓爱德华氏菌的靶器官主要是肝脏和肾脏[2]。迟原可以促进免疫细胞的活性增加,关于这一点,作者缓爱德华氏菌侵入后,释放其胞外和胞内毒素,刺激还将在研究疫苗免疫的过程中进一步进行验证。肠黏膜分泌大量黏液,黏液中的蛋白水解酶等物质可以杀灭病菌,病菌进入血液循环后,血液中的单核细胞剧增,可在病灶处迅速发挥吞噬作用,免疫器官如脾脏和肾脏的造血组织增生,特别是颗粒细胞的变化较大,一方面有大量的小型颗粒产生,另一方面大型胞剧增,可在病灶处迅速发挥吞噬作用,免疫器官如脾脏和肾脏的造血组织增生,特别是颗粒细胞的变化较大,一方面有大量的小型颗粒产生,另一方面大型参考文献1池上裕治。养殖,1996,33(11):74~752RashidM.M.,NakaiT.,MurogaK.etal..FishSci.,1997,63(3):384~387 脾脏和肾脏的造血组织增生,特别是颗粒细胞的变化较大,一方面有大量的小型颗粒产生,另一方面大型颗粒细胞的吞噬功能增强,常出现吞噬小体和自噬小EFFECTOFINJECTIONOFEdwardsiellatardaONTHE IMMUNEORGANOFBASTARDHALIBUT(Paralichthyso livaceus)LIUYunJIANGMingJIANGGuoliangYANGDongZHANGShicui(OceanUniversityofQingdao,266003)Received:Jun.,28,2000KeyWords:Edwardsiellatarda,Bastardhalibut(Paralichthysolivaceus),ImmuneorganAbstractAfterBastardhalibut(Paralichthysolivaceus)waspouredinEdwardsiellatardathroughmouth,theimmunocyte's immunocompetentofpronephrosandspleenincreasedbecausethenumberofmonocytesaddedandlargegranule'sinchon driosisstrengthened,alsomanysmallgranulesproducedingranulocytes.Butthebacteriacanalsodamagetheimmunecell, suchascellhydrops,membranestructuredestructionandcellnecrosis.Thestructureofprenephros,spleen,liver, gutand bloodandultrastructureofprenephros,spleenandliverweredescribed.Theresultswillprovidegoodcellmorphologybasis whenusingvaccine.(本文编辑:刘珊珊)46海洋科学/2000年/第24卷/第12期