114例hbsag阳性孕妇及其新生儿pbmc 感染hbv的状况论文

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1、114例HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMC感染HBV的状况论文王效军王素萍李铁钢冯永亮【关键词】外周血单个核细胞；乙型肝炎病毒；原位杂交【摘要】目的：了解HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMCHBV感染状况。方法：采用原位杂交(ISH)技术检测114例孕妇和新生儿PBMC涂片中HBVDNA。结果：114例HBsAg阳性孕妇及其新生儿PBMCHBVDNA的检出率分别为28.07%（32/114）和32.46%（37/114）；HBsAg阳性孕妇与其新生儿之间的PBMCHBV感染存在一致性（Kappa=0.52,P0.01）。结论：证实HBsAg阳性孕妇与其新

2、生儿之间的PBMCHBV感染存在一致性。【关键词】外周血单个核细胞；乙型肝炎病毒；原位杂交【Abstract】Objective：ToobservethestatusofHBVinfectioninperipheralbloodmononuclearcells(PBMC)fromtheHBsAgpositivemothersandtheirneonates.Methods：Insituhybridization(ISH)earfrom114HBsAgpositivemothersandtheirsneothersandtheirneonatesentoft

3、heHBVinfectionstatusbetothersandtheirnethemothersagreestheirneononuclearcells;hepatitisBvirus;insituhybridization乙肝病毒（hepatitisBvirus，HBV）宫内感染是导致我国HBsAg慢性携带的重要原因，HBV宫内传播是HBV宫内感染的重要途径，其机制复杂多样。临床上乙肝疫苗（hepatitisBvaccine，HBVac）和乙肝免疫球蛋白（hepatitisBimmuneglobulin，HBIG）的联合应用不能完全阻断HBV母胎之间的

4、宫内传播（intrauterinetransmission），有研究［1］证实在HBsAg阳性孕妇及其新生儿外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMC）中均可检出HBV复制中间体（covalentlyclosedcircular,cccDNA）。HBV感染PBMC.freelin离心30min；吸取单核细胞层于另一试管，加2mLHank，s平衡盐溶液，1000r/min离心10min，再重复洗涤2次；洗涤后的细胞用30μLHank，s溶液制成细胞悬液；取5～10μL涂于经APES（3氨丙基3乙氧基甲硅烷）防脱

5、处理的载玻片上；70%乙醇固定，自然晾干，4℃保存备用。1.2.2HBVS基因探针的制备（1）PCP10HBVDNA重组质粒DNA的提取：吸取1.0～1.5mL复苏的PCP10质粒培养液于1.5mL离心管中，4℃下14000r/min离心30s；吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥；将细菌沉淀重悬于0.5mLSTE，4℃下14000r/min离心1min；吸去上清，使细菌沉淀尽可能干燥；将细菌沉淀重悬于冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡后加入200μL新配制的溶液Ⅱ（盖紧管口，快速颠倒5次，不要震荡），置于冰上3min；加150μL冰预冷的溶液Ⅲ（盖紧管口，将管倒置后

6、温和地震荡10s，之后将管置于冰上3～5min），4℃下14000r/min离心10min，将上清转移至另一1.5mL离心管中；加1倍上清体积的酚:氯仿(1∶1)，震荡混匀，4℃下14000r/min离心2min，将上清转移至另一1.5mL离心管中；加2倍上清体积的95%乙醇，振摇混合，室温静置2min，14000r/min离心10min；小心吸去上清，离心管倒置于滤纸上，使所有液体尽量流出，再用滤纸除尽附于管壁的液滴；再加入70%乙醇1mL，4℃下14000r/min离心5min以洗涤DNA沉淀；再小心吸去上清，离心管倒置于滤纸上，使所有液体尽量流出，用

7、滤纸除尽附于管壁的液滴，空气中干燥10min，30μLTE缓冲液溶解，-20℃保存。（2）HBVS基因双链DNA裸探针的制备及标记：采用PCR法扩增HBVS基因，引物选自HBVS基因启动子和终止子附近的保守序列［3］（189～689nt），由上海生工生物工程技术有限公司合成，扩增片断长度为500bp，引物序列为：HBVSP15’CCTGTCCGTGTTACAGGC3’（上游引物）HBVSP25’GGCATCAGTAAACTGAGC3’（下游引物）以提取的HBVDNA为模板，以P1、P2为引物，总反应体积50μL，具体反应体系包括：10×Buffer5μL、

8、0.025mol/LMgCl24μL、0.01mol/LdNTP1