nogo受体拮抗剂对大鼠急性脊髓损伤的保护作用

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1、Nogo受体拮抗剂对大鼠急性脊髓损伤的保护作用作者：吴继彬，杨惠林，张钦，邱志杰，丁涛【摘要】目的探讨Nogo受体拮抗剂NEP1-40对大鼠脊髓损伤后脊髓功能恢复的影响，为临床治疗急性脊髓损伤提供实验依据。方法健康ethods48healthyentalgroup(NEP1-40group).Ratmodelofmiddlethoracicspinalcordposthalftranssectionentalgroupplescollectedfromeachgroupundermunofluorescencestaining.Ratbehaviorfunctione

2、pointsasthepost-injury1and3days,1,2,3and4acontrolgroup.ThepositiveimmunofluorescenceareaofNeuN/NF-200inNEP1-40groupentofSCIisabletopromotenerveaxonregenerationofinjuredsitesandrehablitatespinalelectrophysiologicalandmotorfunctions.　　Keyle等［3］方法制作脊髓半横断模型。大鼠经腹腔麻醉后固定于立体定位仪上，常规消毒，以第8胸椎(T8)棘

3、突为中心，手术显露棘突。手术显微镜下打开T8椎板，用刀片做T10脊髓的后半横断，损伤深度1.0mm（横断后侧和后外侧皮质脊髓束）。向尾侧硬脊膜下置入硬脊膜管（PE-10导管，BD公司），盐水冲洗切口，固定硬脊膜管，依次缝合，模型制作完成。　　生理盐水对照组通过置管每天注入生理盐水20μl，NEP1-40组每天用微量进样器注入NEP1-4010μl(0.4μg/μl)。每天分早、中、晚3次注射，每次注射完毕后用10μl生理盐水冲管，以保证药物进入蛛网膜下腔，连续使用4周。术后人工挤压膀胱排尿，每天3次，直至形成排尿反射。术后3天给予青霉素4万U／只。硬脊膜管外口予无菌保

4、护，定期换药。　　1.4标本的收集和处理　　所有动物均分别于脊髓损伤1、2、3、4周时用4%多聚甲醛经左心室-主动脉灌注后取出脊髓组织，灌注液中固定12h左右，然后放入30%蔗糖溶液中，待组织沉底，冰冻切片机切片，厚度30μm。　　1.5检测指标　　1.5.1组织学检查　　苏木精-伊红染色，观察脊髓的组织学改变。　　1.5.2免疫荧光组织化学双重标记染色　　选取脊髓切片经兔抗大鼠NeuN抗体(1∶500)﹑小鼠抗大鼠NF-200抗体(1∶400)4℃孵育过夜，再用抗兔IgG-FITC(1∶100)﹑抗小鼠IgG-RBITC(1∶100)37℃孵育1h，封片后用LEic

5、a激光共聚焦扫描显微镜观察免疫荧光双标结果。　　1.6运动功能评定　　采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)［4］运动评分法。在80cm×130cm×30cm覆盖有防滑纸板的箱子中，每只实验鼠由2名非实验人独自观察4min，对后肢的运动功能进行评分。0～21分的分级是根据关节的运动、体重的支撑、前后肢的协调和尾的位置等情况而定。0分代表大鼠后肢无运动，21分表示大鼠后肢运动功能正常。BBB评分分别于术后第1、3、7、14、21、28天进行。　　1.7图像分析　　免疫组化染色结果采用德国KONTRONIBAS2.5全自动图像分析系统，在损伤的头尾两

6、侧，分别取10个视野，计算免疫荧光阳性神经细胞数。　　1.8统计学处理　　SAS9.0统计软件对数据进行统计学处理，计量数据用±s表示。2组实验大鼠BBB评分，采用具有一个重复测量的两因素设计的方差分析，比较不同时点指标的变化趋势。2组免疫荧光染色阳性反应的比较采用成组设计资料t检验。检验水准（双侧）：α=0.05。　　2结果　　2.1组织改变　　4周时苏木精-伊红染色显示生理盐水对照组出现神经元固缩、坏死、溶解，细胞体积变小；白质中见较多红细胞渗出，髓鞘肿胀和大量空泡；并有炎性细胞浸润和胶质细胞增生。NEP1-40实验组灰质肿胀变形、出血、小胶质细胞增生和炎性细胞浸

7、润均较损伤组轻；白质点状出血，白质中有较多的正常轴突(图1)。　　2.2免疫组化　　激光共聚焦扫描显微镜观察到脊髓损伤1、2、3、4周后神经元的胞体和细胞核均增大，胞质和轴突的NF-200免疫染色为阳性，并且与NeuN共定位(图2)。从NF-200染色阳性神经元数目的统计分析可见，脊髓损伤3周后NEP1-40实验组明显高于生理盐水对照组(P<0.05)(表1)。表1实验大鼠不同时期NF-200的阳性细胞数(略)　　2.3行为学观察　　术后动物均呈现双后肢瘫痪，随时间推移，2组动物的神经功能均有不同程度的恢复。脊髓损伤后1天～2周，BBB评分两组