抗河豚毒素之基因工程单链抗体制作方法探析

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1、抗河豚毒素之基因工程单链抗体制作方法探析第二章噬菌体展示的概述1896年，在印度的Gangs和Jumna两条河的中，英国的细菌学家发现了一些未知生物，它们具有明显的抵抗霍乱弧菌的作用。1971年，法国的研究人员发现了一个奇怪的现象，他们将一种无菌的污水滤液加入到新鲜的志贺痢疾杆菌的液体培养物中后，发现志贺痢疾杆菌被分解了，并且原来浑浊的液体培养物变得澄清，说明在这种无菌的污水滤液中存在着某种未知的生物或者物质[107，108]。后来被证明了，他们之前所发现的现象是由一种被称为噬菌体的生物造成的。他们发现的那

2、些未知的生物正基因工程的论文是噬菌体。噬菌体（phage）是一种病毒，它的宿主是细菌等微生物，如：细菌、真菌、放线菌、螺旋体等微生物。噬菌体在环境中和生物体中是广泛存在的，与自然界中的其他生物一样，都促使着整个自然的平衡发展。噬菌体展示技术是一种分子技术，通过这种技术，我们可以将外源蛋基因工程药物的论文白表达在噬菌体颗粒的表面。这时噬菌体就成为了一种表达载体，它不仅可以表达自身核苷酸编码的蛋白质，还可以表达插入的外源基因编码的蛋白质，同时还保留着复制繁殖的能力，进而使外援蛋白得到大量的表达。利用该技术，我们

3、可以插入大量的变异的、不同的核苷酸序列，这样就会对应的在噬菌体颗粒表面表达出不同的、变异的多肽，然后我们可以根据实际需要进行筛选。本文将会从基本的噬菌体展示技术的概念和噬菌体载体的选择、展示系统的分类和应用及前景展望多个方面进行综述。2.1噬菌体展示技术的概念和噬菌体载体的选择2.1.1概念噬菌体展示，在噬菌体颗粒的表面表达外源的多肽，进而将噬菌体定位到不同的目标分子上。这一项技术已经演变为一种在新药发现和确定工程多肽的新功能上的功能强大的新技术[109-113]。当我们将外源的DNA片段插入到线性的噬菌体

4、的基因组中后，由外源基因片段编码的外源多肽就会以一种融合蛋白的方式与噬菌体自身的包衣蛋大学基因工程论文白融合表达在噬菌体颗粒的表面。在噬菌体颗粒表面展示多肽这项技术和建立一个重组的多肽库的概念相结合，可以作为一种筛选我们目的物的一种新技术。这个想法的最初实现在1985年，当时就是选择了线性的噬菌体作为表达的载体[114]。在1985年，Sm转基因技术论文ith建立了在噬菌体颗粒表面表达多肽的这种技术，他用一种病毒去侵染大肠杆菌，这种线性噬菌体（如：M13）相比于其他的噬菌体（如：T4），它不仅可以自我复制组

5、装，而且还不会杀死宿主细胞。由于史密斯的这一项开创性的工作，建立在这种温和噬菌体的基础上的噬菌体展示技术已经演变成为了一种被广泛使用在一个分子库中筛选我们所需要的功能或性能的目的蛋白或多肽的一种技术。噬菌体展示系统的最基本原则就是，多肽的表型和基因型是相一致的。在实践中表达的蛋白或者多肽通常都是和噬菌体的外壳蛋白pIII或pVIII蛋白融合表达的[115]。这样的融合蛋白一般都都在其N端有一个适当的信号序列将其定向到细菌的周质空间或者细胞内部[116]。在噬菌体组装过程中，表达的融合蛋白也被纳入新生的噬菌体

6、颗粒中。可以编码外源蛋白的遗传信息被整合到相同的噬菌体颗粒的单链DNA（ssDNA）分子上。所以，基因型和表型的耦合是发生在噬菌体被释放的细胞外环境之前，这样可以确保从相同的细菌细胞产生的噬菌体克隆是完全相同的。在这种方式下，通过一个批量克隆的基因库可以创建一个容量大约在1010pfu/mL的巨大的噬菌体展示库。多数应用噬菌体展示库的目的是确定可以和一个给定的目标分子绑定的目的多肽。富集那些已经展示了我们的目的多肽的噬菌体克隆的主要方法就是通过从噬菌体库中固定化亲和选择。在这种筛选的方法中，我们收集可以结合

7、的噬菌体，那些不能结合的噬菌体通过一定的缓冲液洗掉，然后将结合的噬菌体稀释并通过重新感染大肠杆菌的方式来扩增，扩增得到的噬菌体可以用于进行下一轮的筛选。这是很典型的噬菌体库筛选要涉及到的步骤。简而言之，噬菌体库的筛选是一个选择富集谈后扩大培养的循环过程。第二章抗河豚毒素的噬菌体抗体文库的构建和淘选...............................................................35第二篇研究内容...................................

8、.......................................................................................19第一章河豚毒素人工完全抗原的制备.......................................................................................19第三章SCFV-T53的性质