哇巴因诱导jurkat细胞凋亡与胱冬酶

《哇巴因诱导jurkat细胞凋亡与胱冬酶》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡与胱冬酶作者：熊安秀，王敏，金润铭，白燕，林雯【摘要】本研究探讨哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡及其机制。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法观察哇巴因对Jurkat细胞生长的抑制作用，应用流式细胞术、原位末端标记技术（TUNEL）等观察细胞凋亡，应用edicalCollegeofSanxiaUniversity,Yichang443003,China;1DepartmentofPediatrics,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversity

2、ofScienceandTechnology,TTmethodetry(FCM)andtheterminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddeoxyuridinetriphosphatenickend-labelingreactionmethod(TUNEL).TheprotEinexpressionsofBax,Bcl-2andactivesubunitsofcaspase-3easuredbyannheins公司产品；鼠抗人Bcl-2、Bax单克隆抗体、兔抗人caspase-3多克

3、隆抗体购自SantaCruz公司；caspase-3活性检测试剂盒购自Clontech公司。　　细胞生长抑制分析（MTT法）　　接种细胞于96孔板，实验体系总体积为180μl，细胞终浓度为1×106/ml，加入不同浓度的哇巴因（1、10、50、100μmol/L）培养24小时，加入20μlMTT（5g/L）后继续培养4小时，去上清加入200μl二甲亚枫（DMSO），用BIO-TEK酶标仪测定吸光度（A）值（OD值），每个浓度设3个复孔，完全培养液和磷酸盐缓冲液分别作为空白对照和阴性对照。细胞生长的抑制率按下式计算：增殖抑制率=

4、（1-实验孔A值/对照孔A值）×100%　　细胞凋亡的TUNEL法检测　　收集对照组及哇巴因处理组的细胞，调细胞浓度为1×106/ml，取100μl细胞悬液经LTP-B离心涂片机甩片，室温稍干燥后用4%多聚甲醛4℃固定15分钟，依试剂盒说明书依次加入封闭液、透化液、50μlTUNEL反应液、50μlAP转换液和50μlBCIP/NBT底物液测定细胞凋亡，设不加TdT酶为阴性对照。光学显微镜高倍镜（×400）下观察，计数200个细胞，细胞染成致密蓝色者为阳性细胞，即调亡细胞，计算阳性表达率（%），共计数3次，取平均值。　　细胞凋

5、亡的PI染色分析　　收集1×106个细胞于离心管中，1000×g离心5分钟，用预冷PBS洗1次，70%冰乙醇（-20℃）固定，-20℃保存，检测前离心去除固定液，加入含有10μg/ml的PI和0.1%RNaseA的PBS，室温闭光染色30分钟，上流式细胞仪检测，记录激发波长488nm处的红色荧光，然后经ModFitLTR软件收集、储存和分析，每份标本检测10000个细胞，凋亡百分率用百分数表示。　　Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达的分析表明：所有受检标本显示有DNA低含量颗粒（"亚G1期峰"），系列浓度的哇巴因（

6、10、50、100μmol/L）处理Jurkat细胞12小时，细胞的凋亡率分别为7.20%、15.01%、24.90%，对照组为310%，显示出浓度依赖效应。　　哇巴因对Jurkat细胞凋亡的影响　　TUNEL法检测结果显示，未经哇巴因处理细胞的凋亡百分率为(3.667±0.577)%，50μmol/L哇巴因处理Jurkat细胞8、16、24小时，凋亡细胞百分率分别为：(9.667±1.523)%、(17.667±2.517)%和(25.667±2.082)%，与对照组比较，差异有显著性（P<0.01）；不同浓度（1、

7、10、50、100μmol/L）哇巴因作用Jurkat细胞24小时，凋亡细胞百分率分别为：(9.333±0.577)%、(16.667±1.523)%、(26.334±1.528)%和(40.668±2.512)%，与对照组比较，差异有显著性（P<0.01），诱导凋亡作用随哇巴因浓度的升高和作用时间的延长而加强。　　哇巴因诱导Jurkat细胞凋亡时Bcl-2、Bax蛋白的表达变化　　Jurkat细胞Bcl-2、Bax蛋白的表达采用Bcl-2、Bax与β-actin积分吸光度比值来表示，未处理的Jurkat细胞均有Bcl-

8、2、Bax蛋白的表达，系列浓度的哇巴因（1、10、50μmol/L）作用于Jurkat细胞24小时，用药前后Bcl-2蛋白的表达无明显改变，而Bax蛋白表达用药后明显增高，呈浓度依赖趋势，差异有显著性（P<0.01）（图1，附表）。Table.ExpressionofB