紫外诱变复合重金属离子抗性突变选育霉酚酸高产菌株

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1、紫外诱变复合重金属离子抗性突变选育霉酚酸高产菌株作者：娄忻贾啸静刘胜利张华【摘要】以霉酚酸产生菌1321#为出发菌株，采用紫外线诱变并复合重金属Cr6+、Cu2+抗性株筛选，获得一株遗传性状稳定且摇瓶发酵水平提高86.6%的164#高产菌株。经发酵配方优化，该菌株的摇瓶单位再度提升了5.5%，显示出了高产潜力。【关键词】霉酚酸；诱变；重金属离子；抗性筛选ABSTRACTAmycophenoilcacid(MPA)producingstrainPenicilliumbrevipactum#1321etalCr6+andCu2+.A

2、stablestrain#164provedby5.5%intheoptimizedfermentationmedium.KEYycophenoilcacid;Mutagenesis;Heavymetalion;Resistantscreening霉酚酸(mycophenoilcacid，MPA)为短密青霉(Penicilliumbrevipactum)产生的抗真菌、抗肿瘤并具免疫抑制作用的抗生素［1］。MPA是次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶的可逆性抑制剂，能选择性地抑制淋巴细胞活性，它的2-乙基酯类衍生物——霉酚酸酯(MMF)是新一代

3、免疫抑制剂，在临床器官移植和自身免疫性疾病的治疗方面展示了良好的应用前景。做为合成MMF的前体化合物，提高MPA的工业化水平对于生产企业来说十分重要。MPA产生菌原始菌株的产量有限，其高产菌株的选育研究近年来渐成热点。张琴等［2］报道采用紫外线及亚硝基胍诱变产生菌，以MPA和三氟乙酸为抗性筛选标记，筛选到了高产突变株；杨亚勇等［3］报道紫外线和亚硝酸复合诱变MPA产生菌的原生质体，经原生质体再生获得了高产菌株。本文报道了应用紫外诱变与定向筛选重金属离子抗性株相结合的方式，进行MPA育种研究，并获得了高产稳定的突变株。1材料与方法

4、1.1出发菌种短密青霉(Penicilliumbrevipactum)1321#。1.2培养基及培养条件(1)分离及斜面培养马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，26℃培养5d～7d。(2)种子培养淀粉10g，葡萄糖5g，酵母粉3g，氯化钠1g，硫酸镁0.5g，碳酸钙1g，自来水1000ml，自然pH。26℃，220r/min摇床，培养2d。(3)发酵培养淀粉12g，蔗糖50g，玉米浆50g，鱼粉蛋白胨2g，酵母粉13g，硫酸铵4g，磷酸二氢钾1g，氯化钙2g，碳酸钙0.5g，自来水1000ml，自然pH。26℃，220r/min摇

5、床，培养7d。1.3菌种诱变与筛选(1)紫外照射单因子处理由出发菌株的成熟斜面制得单孢子悬液置平皿中，紫外灯(30PA对照品为Sigma公司产品。2结果2.1菌种诱变系谱2.2摇瓶筛选结果出发菌株1321#经过UV诱变处理结合Cr6+、Cu2+抗性株筛选，最终获得164#高产突变株，其摇瓶产量比1321#提高了86.6%(表1)。由表1可见，UV+Na2CrO4复合处理筛选到的942#菌株的产量提高幅度最大，随后进行的UV+CuSO4复合处理得到的164#菌株其发酵单位进一步提升。2.3高产突变株的菌落形态变化164#高产突变株

6、的菌落形态与原始菌株1321#相比有了较大变化。1321#为圆形扁平状菌落，而164#的菌落中央凸起，呈对称性放射褶皱状。且有直径变小、孢子量减少的趋势。表1三种诱变筛选方式获得正变株(系谱菌株)的相对摇瓶产量以出发菌株CK1321#摇瓶产量为100%计。2.4高产菌株遗传稳定性考察164#菌株经连续四次斜面传代后与F1代进行摇瓶发酵单位的比较，其子代效价与F1代基本持平。证明该菌株的遗传稳定性良好。2.5发酵配方优化以164#做为试验菌株，对发酵培养基中的淀粉、蔗糖、酵母粉、鱼粉蛋白胨、玉米浆进行U15(155)均匀设计试验。

7、经验证，配方优化后164#菌株的摇瓶单位提高了5.5%。3讨论我公司的MPA产生菌系从土壤中分离得到的野生菌株，经过前期的诱变育种工作，本试验出发菌株1321#的发酵能力已达到产业化水平。为进一步增强产品的市场竞争力，我们面临的任务是选用快速有效的育种手段，短期内将菌种的单位产量大幅提高，以满足生产的需求。在菌种选育过程中，诱变和筛选方法的选择是十分重要的。Cu2+、Cr6+等重金属离子对微生物有一定毒性［4］，当培养基中的重金属离子达到一定浓度时大多数产生菌的生长被抑制，只有对该金属离子具有抗性的菌株才能生长。抗性的机制可能是

8、由于菌体分泌大量产物或其中间体和有毒的金属离子结合，形成无毒或低毒的复合物以解除对菌体自身的抑制作用［5］，并使之失去终产物的反馈控制。这样就可以从金属离子抗性突变株中筛选到能大量产生目的产物的高产菌株。我们对1321#菌株采用了包括UV诱变以及UV复合Cr6+