益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡大鼠缺氧诱导因子

《益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡大鼠缺氧诱导因子》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡大鼠缺氧诱导因子作者：阙华发，朱元颖，王云飞，张臻，徐杰男，邢捷，唐汉钧【摘要】探讨益气化瘀中药对糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证大鼠缺氧诱导因子-1α（hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α）和血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrol;拆方益气方由生黄芪和太子参组成，剂量比例为1∶1，大鼠给药剂量为6.75g/（kg·d），减压浓缩至含生药1.5g/ml;拆方化瘀方由桃仁和地龙组成，剂量比例为1∶1，大鼠给药剂量为4.86g/（kg·d），减压浓缩至含生药1.0g/ml。以上中药均由上海中医药大学

2、龙华医院制剂室按水煎醇沉工艺制备，4℃冰箱保存备用。碱性成纤维细胞生长因子（basicfibroblastgroethod，S-P）试剂盒，美国Zymed公司产品;EnVision试剂（HRP/Rabbit）即用型，丹麦Da-ko公司产品;缺氧诱导因子-1α（hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α）、血管内皮细胞生长因子（vascu-larendothelialgropus公司产品;BH2数码相机，Nikon公司产品。　　1.5糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证大鼠模型的建立给大鼠喂饲高脂饲料（4%胆固醇，10%猪油，0.2%甲基硫氧嘧啶，0.5%胆酸钠，

3、85.3%基础饲料）10d后，以pH4.6，0.1mmol/L的枸橼酸钠缓冲液溶解链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），配成1%溶液，以60mg/kg的剂量连续腹腔内注射STZ溶液2d，72h后动物血糖浓度大于16.7mmol/L及尿糖为（++++）时，即成糖尿病气虚血瘀证大鼠模型。将大鼠用盐酸氯胺酮（100mg/kg）腹腔注射麻醉后，造模区（腰椎正中偏上）剪毛，用直径15mm的图章标记造模面积，在无菌条件下，沿脊椎方向用外科方法作两条深达筋膜，直径为1.5cm的创面，造成全层皮肤缺损开放性创面模型。加盖两层消毒干纱布，用胶布“丰”字形固定。造模后每只大鼠连续

4、4d后腿肌肉注射青霉素40万U［2～4］。　　1.6实验动物分组与给药方法72只大鼠先随机抽取8只为正常对照组，创面制作方法同前;其余64只大鼠建立糖尿病皮肤溃疡气虚血瘀证模型，造模过程中，未成糖尿病模型的7只，死亡3只。54只大鼠成模后再随机分为益气化瘀组（10只）、益气组（11只）、化瘀组（11只）、贝复济组（11只）、模型组（11只）。各组于造模后次日开始给药，换药前均以1/5000呋喃西林溶液清洁创面。正常对照组及模型组外敷单层生理盐水纱布，生理盐水灌胃，1次/d;益气化瘀组、益气组、化瘀组外敷单层生理盐水纱布，中药灌胃，1次/d;贝复济组外敷以贝复济浸透纱布，按创

5、面大小剪成小块贴于创面上，然后均在创面上加盖两层消毒干纱布，用胶布“丰”字形固定，生理盐水灌胃，1次/d。连续用药7d，停药后次日，分别将动物麻醉（氯胺酮）处死，取局部创面新生肉芽组织为所需实验样品。　　1.7HIF-1α和VEGF的检测　　1.7.1免疫组织化学S-P法取各组大鼠创面新生肉芽组织，生理盐水清洗后，10%甲醛溶液固定。每组随机选取8个样本，将已固定的各肉芽组织标本分别常规脱水，浸蜡，包埋，连续切片。取4μm石蜡切片，二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水。PBS洗涤3次，3min/次;3%H2O2室温20min，PBS洗涤3次，3min/次;将切片浸入0.01mol/

6、LpH6.0柠檬酸盐缓冲液中，微波Ⅲ档（98℃）2次进行抗原修复，10min/次，取出后在室温下自然冷却;滴加10%正常血清封闭内源性非特异性抗原，室温30min;滴加一抗（分别为上述抗体及相应抗体稀释度），4℃冰箱过夜;PBS洗涤3次，3min/次;滴加生物素化羊抗兔IgG1∶200，37℃30min;PBS洗涤3次，3min/次;Streptavidin-HRP1∶200，37℃30min;PBS洗涤3次，3min/次;0.05%DAB+0.03%H2O2显色8～12min，流水洗;苏木素衬染，流水洗;吹干，常规树脂封片。检测以胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒者判定为阳性细胞

7、，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。　　1.7.2图像分析法采用MV-CP410摄像机、IMS细胞图像分析系统，通过显微镜、图像采集卡、数码相机或CCD摄像机采集数字图像，数字图像为标准的BMP（位图）文件格式;在100倍显微镜下，先点击图像微尺上的两个点，再将它的实际微米数输入计算机，计算机自动计算得到比例因子后存储备用;消除免疫组化图像中的紫蓝色背景;选择阴性区域，处理后用蓝色表示;选择棕黄色或棕褐色阳性区域，处理后用红色表示;测定图像中阳性区域面积和阳性比率以及光密度值;每张切片随机选取3个视野，求出3个视