编码表皮生长因子受体ⅲ型突变体pep

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1、编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP作者：段小艺，王健生，郭佑民，刘敏，周斌，王全颖，杨广笑【关键词】基因克隆　　摘要：目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP3表位的cDNA片段，为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物，正负引物互为模板进行PCR扩增，制备出两端含酶切位点的PEP3cDNA片段，再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEMTEasy构建重组质粒pGEMTEasy/PEP3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实，编码PEP3的cDNA片段被成功扩增

2、并亚克隆于载体pGEMTEasy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP3表位的cDNA片段。　　关键词：表皮生长因子受体Ⅲ型突变体；PEP3表位；cDNA；基因克隆　　ABSTRACT:ObjectiveThroughcloningthecDNAfragmentencodingPEP3epitopeofepidermalgroutant(EGFRvⅢ)toestablishthebaseforimmunotherapyofcarcinomaeraccordingtothebasesequenceofPEP3,cDNAplificate

3、dbyPCR.Then,thePCRproductidpGEMTEasy/PEP3.ResultsZymocuttingrestrictionenzymeidentificationandDNAsequencingconformedthatcDNAencodingPEP3plifiedandsubcolonedintopGEMTEasysuccessfully.ConclusioncDNAencodingPEP3epitopeofEGFRvⅢalgroutant;PEP3epitope;cDNA;clone　　表皮生长因子受体(epidermalgr

4、oHⅠ酶切位点(GGATCC)。正反向引物间有12对互补碱基，由北京赛百盛基因技术有限公司负责合成，HPLC纯化。　　1.3目的基因的扩增和纯化以正、负向引物互为模板进行PCR扩增。PCR反应过程如下：94℃预变性5min，40℃退火1min，72℃延伸70s，循环30次，72℃延伸5min。经酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，700mL/L乙醇洗涤沉淀后用10μLTE充分溶解沉淀。取1μLPCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳，并对产物进行定量。　　1.4重组质粒pGEMTEasy/PEP3的构建与鉴定取上述PCR产物400ng(0.2μg/μL)、质粒

5、pGEMTEasy25ng(50ng/μL)、T4DNA连接酶5U(5U/μL)、10×T4DNA连接酶缓冲液1μL以及去离子水5μL(总体积10μL)建立连接反应体系，14℃连接16h。取50μL连接产物转化0.1mL感受态大肠杆菌DH5α，从LB平皿(Amp+)中挑取单菌落用碱裂解法小提质粒，经BamHⅠ酶切，筛选出正确重组质粒进行大量制备。对含有目的基因片段的重组质粒进行DNA测序(上海基康生物技术有限公司)。　　2结果　　2.1目的基因片段的扩增与鉴定根据GenBank中EGFRvⅢcDNA序列设计出针对PEP3的两条引物，经PCR扩增后，用

6、10g/L的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，结果显示在约50bp处可见一条扩增条带，此片段长度与预期值相符(图1)。图1琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物（略）　　2.2重组质粒pGEMTEasy/PEP3的鉴定经PCR扩增获得的PEP3cDNA片段与载体pGEMTeasy连接产生的重组质粒用BamHⅠ酶切后质粒被线性化，10g/L琼脂糖凝胶电泳可见一约3050bp的明显条带，证明PEP3cDNA片段已经重组于pGEMTEasy上(图2)。　　2.3重组质粒DNA序列分析以pGEMTEasy通用引物对获得的重组质粒进行DNA序列测定，测定的结果表明插入的PE

7、P3cDNA片段与设计的XhoⅠPEP3BamHⅠ片段序列完全一致，无碱基突变和读码框移位(图3)。图3重组质粒pGEMTEasy/PEP3DNA测序结果（略）　　3讨论　　许多恶性肿瘤均呈现EGFR过表达，以EGFR作为靶点的肿瘤治疗已经取得了令人瞩目的进展，但EGFR在人体许多正常组织亦有表达，使其应用受到限制。EGFRvIII是EGFR配体结合区缺失的突变体，它可在没有配体结合的情况下组成性激活酪氨酸激酶，诱发下游的信号转导途径，引起细胞异常增殖并抑制凋亡。由于EGFRvIII仅高表达于恶性肿瘤组织，正常组织中检测不到，因此以EGFRvⅡ作为靶

8、点为高表达EGFRvIII肿瘤的特异性免疫治疗提供了新的线索。Achim等发现，针对EGFRvⅢ的单克隆抗体