qki蛋白的原核表达、 纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

《qki蛋白的原核表达、 纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

　　QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定黄博,于芳,王孝功,白丽圆,李华,卢兹凡【关键词】QKI　　〔摘要〕目的:获得原核表达的RNA结合蛋白QKI7蛋白,并制备其兔抗QKI多克隆抗体。方法:将成功插入QKI7编码区cDNA的PET32b(+)原核表达载体用热休克法转化BL21(DE3)感受态细菌,以IPTG诱导6×HisQKI7融合蛋白的表达,分别经金属鳌合柱、反向柱和强阴离子交换柱进行层析纯化。经SDSPAGE和ory大学药理系教授冯越惠赠。Ni金属鳌合柱（SepharoseFastFloacia公司。纯种新西兰白兔由本校实验动物中心提供。弗氏佐剂购自GibcoBRL公司。HepG2细胞、Hy906细胞为本室保存的引自美国ATCC的标准细胞株。　　1.2方法　　1.2.1细菌的发酵和裂解将6×His融合表达载体PET32b(+)QKI7转化的大肠杆菌BL21(DE3)接到5mL的LB培养基中,30℃培养过夜,转接细菌到500mL2×YT培养基中,30℃培养10h无菌接种于30L发酵罐中（内有8L培养液,不含抗生素）37℃培养6h后开始流加补料,9h后加入IPTG至终浓度05mmol/L开始诱导,诱导4 h后停止发酵。4000r/min离心25min,收集沉淀,-70℃保存备用。取发酵细菌,按照细菌和裂解液为1∶8的比例加入裂解(20mmol/LTrispH10,3mL/L巯基乙醇,6mol/L盐酸胍),不停搅拌,室温过夜。8000r/min离心30min,收集上清;然后用超声波发生器以1500mol/LTrisHClpH80,150mmol/LNaCl,6mol/L脲)平衡后,取第一步准备的上清直接采用金属鳌合柱层析。上样流速为8mL/min;上样完成后用A液流洗至基线,直接用B液(20mmol/LTrisHClpH80,150mmol/LNaCl,6mol/L脲,200mmol/L咪唑)洗脱,收集目的蛋白峰,准备下一步反相层析纯化。　　1.2.3反相层析纯化QKI7以8mL/min的流速用B液(20mmol/LTrisHClpH80,1mL/L巯基乙醇,5mol/L脲,500mL/L异丙醇)流洗30mL,然后用A液(20mmol/LTrisHClpH80,1mL/L巯基乙醇,5mol/L脲)平衡层析柱至基线,调整紫外吸收至零点。用8mL/min的流速上样,上样结束后用A液流洗至基线,采用20%B液流洗2个柱体积,收集蛋白峰,记为peak1,再用75%B液洗脱2个柱体积,收集蛋白峰,记为peak2,最后用100%B液洗脱2个柱体积,收集蛋白峰,记为peak3。电泳鉴定发现目的蛋白存在于peak2中。收集peak2,准备阴离子柱纯化。　　1.2.4强阴离子层析纯化QKI7 以8mL/min的流速用B液(20mmol/LTrisHClpH80,1mL/L巯基乙醇,5mol/L脲,1mol/LNaCl)流洗30mL,然后用A液(20mmol/LTrisHClpH80,1mL/L巯基乙醇,5mol/L脲)平衡层析柱至基线,调整紫外吸收至零点。用8mL/min的流速上样,上样结束后用A液流洗至基线,采用7%B液流洗2个柱体积,收集蛋白峰,记为peak1,再用20%B液洗脱2个柱体积,收集蛋白峰,记为peak2,最后用100%B液洗脱2个柱体积,收集蛋白峰,记为peak3。电泳鉴定发现目的蛋白存在于peak2中,纯度在95%左右,4℃保存备用。　　1.2.5抗原的Ab(1∶1000稀释),二抗为羊抗鼠HRPIgG（1∶500稀释）,依次加DAB和H2O2显色。　　1.2.6抗体的制备将6只新西兰大白兔随机分成3组,用纯化的6×His融合蛋白分别以弗氏佐剂、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜作为佐剂常规免疫,每次免疫PET32b(+)QKI7融合蛋白200μg。首次免疫后1月进行第2次免疫,其后间隔2周进行第3次免疫,共3次。其中弗氏佐剂组第1,第2次免疫分别用完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂及200μg抗原等体积混合,于腋下和腹股沟区注射,第3次免疫用200μg纯抗原于耳缘静脉直接注射。聚丙烯酰胺凝胶和NC膜组3次免疫均为腋下和腹股沟区注射。3组最后1次免疫2周后,从兔耳静脉采血1mL,以间接ELISA法检测血清抗体效价,其中弗氏佐剂组抗体效价高于1∶105, 聚丙烯酰胺凝胶组和NC膜组抗体效价低于1∶102,颈动脉插管分别收集血清。血清在4℃孵育过夜,离心收集上清,分装冻存于-70以备用。　　1.2.73种不同的免疫策略抗体特异性的鉴定用过表达QKI7的HepG2细胞蛋白提取进行SDSPAGE后,电转移至NC膜上,以100g/L脱脂奶粉封闭过夜,用3组抗QKI血清(1∶700稀释)进行r约40000的蛋白带(图1),与预期的6×HisQKI7融合蛋白Mr相符。经金属鳌合柱（图2）,反相层析柱（source30RPC）（图3）,强阴离子柱（source30Q）（图1）层析法纯化的上述蛋白,在SDSPAGE后几乎为单一条带,纯度达到95%以上。　　图16×HisQKI7融合蛋白的诱导表达和纯化（略）　　1:未用IPTG诱导;2:IPTG诱导4h;3:纯化的6×HisQKI7.　　图26×HisQKI7融合蛋白经金属鳌合柱后纯化结果（略）　　1:金属鳌合柱层析产物;M:蛋白marker.　　图36×HisQKI7融合蛋白经反相层析柱纯化结果（略）　　1:反向层析柱柱层析物;M:蛋白marker.　　2.2抗原的鉴定将未诱导细菌的裂解产物和最终纯化的目的蛋白产物作r约40000的蛋白带反应, 与QKI5的Mr相符。　　2.4所获得抗体对内源性抗原的检测用弗氏佐剂组所产生的抗QKI多克隆抗体（1∶1000稀释）对Hy906细胞的蛋白提取物做r约40000的蛋白带反应,与QKI5的Mr相符（图6）。说明我们所获得的QKI多克隆抗体能检测内源性抗原的表达。　　图5抗QKI多克隆抗体的olCellBiol,1998,18:4863-4871.　　[3]CoxRD,HugillA,ShedlovskyA,etal.ContrastingeffectsofENUinducedembryoniclethalmutationsofthequakinggene[J].Genomics,1999,57:333-341.　　[4]PilotteJ,LarocqueD,RichardS.Nucleartranslocationcontrolledbyalternativelysplicedisoformsinactivatesthequakingapoptoticinducer[J].GenesDev,2001,15:845-858.　　[5]张莹莹,李福洋,张文红,等.一种新的丝氨酸蛋白酶ESP30的表达及其多克隆抗体的制备[J].细胞与分子免疫学杂志,2005,21(3):334-336.　　[6]MezquitaJ,PauM,MezquitaC.FourisoformsofthesignaltransductionandRNAbindingproteinQk1expressedduringchicken spermatogenesis[J].MolReprodDevel,1998,50:70-78.　　[7]刑小红,吴元明.兔抗人Bit1抗血清的制备及其纯化[J].细胞与分子免疫学杂志,2004,20（6）:764.