抗性淀粉和总淀粉测定方法

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1、.WORD.格式.抗性淀粉及总淀粉测定方法采用Megazyme抗性淀粉试剂盒法,测定方法见试剂盒说明书(下附)原理(AOAC法2002.02;AACC法32-40)抗性淀粉的测定方法:样品使用α-胰淀粉酶和淀粉葡糖苷酶(AMG)37℃振荡水浴孵育16小时,在这期间,通过两种酶的联合作用,非抗性淀粉被溶解,水解成D-葡萄糖,孵育结束后,加入等体积的乙醇或工业甲基化酒精(IMS,变性乙醇)终止反应。离心上述溶液,收集上清勿弃,底部残留絮状团即为样品中的RS,用含水的IMS或乙醇(50%v/v)洗涤絮状团,洗涤后离心,再重复一次洗涤离心,收集离心后获得的上清,与之前收集的上清混合。小

2、心倒出试管残留的液体,将絮状团置于冰水浴中,加入2MKOH溶解,溶解的同时用磁力搅拌机剧烈搅拌。用醋酸盐缓冲液将这个溶液调至中性,用AMG将淀粉定量水解成葡萄糖。D-葡萄糖用葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂(GOPOD)测定,这也是对样品中RS含量的测定。非抗性淀粉(可溶性淀粉)的测定可通过集中的上清液并定容至100mL,再用GOPOD测定D-葡萄糖完成。总淀粉测定方法:即抗性淀粉与非抗性淀粉总和。抗性淀粉检测试剂盒K-RSTAR(100次分析)应用性和精确性这个方法需要样品中RS含量多于2%w/w。如RS含量多于2%w/w,常规标准误差为±5%。少于2%w/wRS的误差更高。试剂盒

3、瓶子1:淀粉葡糖苷酶AMG,12mL,3300U/mL,条件为pH4.5,40℃下,底物为可溶性淀粉,[单位或为200U/mL,条件为pH4.5,40℃下,底物为对硝基苯基β-麦芽糖苷]。AMG溶液应完全没有可检测到的游离D-葡萄糖。4℃下稳定性>3年。瓶子2:α-胰淀粉酶(胰酶,10g,3CeralphaU/mg)。4℃下稳定性>3年。瓶子3:GOPOD试剂缓冲液。磷酸钾缓冲液(1M,pH7.4),对羟基苯甲酸(0.22M专业整理资料分享.WORD.格式.)和叠氮化钠(0.4%W/V)。4℃下稳定性>3年。瓶子4:GOPOD试剂酶。葡糖氧化酶(>12,000U)加上过氧化物酶

4、(>650U)和4-氨基安替比林(80mg)。冻干粉,-20℃下稳定性>5年。瓶子5:D-葡萄糖标准溶液(5mL,1.0mg/mL)溶于苯甲酸0.2%(w/v)。室温下稳定性>5年。瓶子6:抗性淀粉对照。抗性淀粉含量如表所示。室温下稳定性>5年。溶液/悬浮液的制备1.使用瓶子1中提供的的产品(AMG;溶液1)。这个溶液是有粘性的,因此应使用正向移液器移取分装。4℃下稳定性>3年。稀释AMG(300U/mL)。取2mL瓶子1中的AMG浓缩液用0.1M顺丁烯二酸钠缓冲液(0.1M,pH6.0;试剂1,非提供)稀释至22mL。以5mL为单位分装后用聚丙烯管冷冻保存。反复冻融不会影响稳

5、定性,稳定性-20℃>5年。用前制备2.用100mL顺丁烯二酸钠缓冲液(100mM,pH6.0;试剂1,非提供)悬浮1g瓶子2中的产品(α-胰淀粉酶),搅拌5分钟。加入1.0mL稀释的AMG(300U/mL),混匀。>1500g离心10分钟,慢慢倒出上清液,这就是制备的溶液2。溶液2制备后应当天使用。3.用蒸馏水稀释瓶子3中的产品(GOPOD试剂缓冲液)稀释至1L,这就是制备的溶液3。制备后马上使用。备注:(1)如果浓缩缓冲液在-20℃下储存,它将形成结晶盐,因此必须要完全溶解才可以用蒸馏水稀释。(2)这个缓冲液包含0.4%(w/v)的叠氮化钠。因此这是个有毒化学物,应进行相应

6、的处理。4.取瓶3中制备好的溶液320mL溶解瓶子4里全部的产品,定量转移这个溶液至装有剩余溶液3的瓶子中。用铝箔封盖瓶子以遮光。这就是葡萄糖测定试剂(GOPOD试剂),可以在2-5℃保存3个月或者-20℃下保存一年。如果试剂要以冷冻态储存,应分装后再冻存。当试剂是新鲜制备的,它的颜色应是浅黄色或浅粉色。在4℃专业整理资料分享.WORD.格式.储存2-3个月时会演变成深粉色。当以蒸馏水为对照时,这个溶液的吸光度应小于0.05。5&6.使用瓶子5或6提供的产品。室温下稳定性>5年。没有提供的试剂(应购买分析纯级)1.顺丁烯二酸钠(马来酸钠)缓冲液(100mM,pH6.0)加上5m

7、M二水氯化钙和叠氮化钠(0.02%w/v).用1600mL蒸馏水溶解23.2g顺丁烯二酸,用4M(160g/L)氢氧化钠调节pH至6.0,加入0.74g二水氯化钙和0.4g叠氮化钠,并溶解。定容至2L。4℃下可保存一年。2.醋酸钠缓冲液(1.2M,PH3.8)将69.6mL的冰醋酸(1.05g/mL)加至800mL的蒸馏水中,用4M氢氧化钠调节pH至pH3.8。用蒸馏水定容至1L,室温下可保存一年。3.醋酸钠缓冲液(100mM,PH4.5)将5.8mL的冰醋酸加至900mL的蒸馏水中,用4M

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