mmp2、mmp9和vegf在肾癌中的表达与临床意义

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1、MMP2、MMP9和VEGF在肾癌中的表达与临床意义卜宏民王连渠闫拥军焦志灵徐国良【摘要】目的探讨基质金属蛋白酶2、9(MMP2、MMP9)与血管内皮生长因子（VEGF）在肾癌组织中的表达与临床分期的意义。方法蛋白免疫印迹法、ELISA和逆转录聚合酶链反应法（RTPCR）检测癌组织MMP2、MMP9，蛋白质免疫印迹法和RTPCR检测癌组织VEGF。结果肾癌组织中MMP2、MMP9和VEGF明显表达，随着病程的进展MMP2、MMP9和VEGF活性逐渐增高，以Ⅳ期晚期最明显，VEGF与MMP2、MMP9表达具有正相关性。结论MMP2、MMP9和VE

2、GF参与了肾癌临床病情进展和发病机制。【关键词】肾癌；基质金属蛋白酶；血管内皮生长因子基质金属蛋白酶(MMP2和MMP9）及其组织抑制物因子(TIMPs)在恶性肿瘤浸润转移中的作用已成为研究热点〔1，2〕，其中能够水解基底膜主要成分Ⅳ型胶原的MMP2(明胶酶A)、MMP9(明胶酶B)由于参与了细胞外基质(ECM)的降解和血管的发生，被认为在恶性肿瘤的浸润转移中发挥重要的作用〔2〕。血管内皮生长因子（VEGF）是一种增加血管通透性并促进新血管生长的细胞因子，在许多恶性肿瘤呈高表达并与侵袭转移和预后等生物学行为关系密切，可能与肿瘤及肿瘤转移灶的生长中的血管生成有关〔3，4〕。

3、但三者在肾肿瘤组织中表达及其关系的文献报道的还不多，本文检测了肾癌组织中MMP2、MMP9和VEGF的表达，探讨其与肾癌临床分期的关系与意义。1资料与方法1.1一般资料67例肾癌标本取自2004年1月～2007年10月在本院外科手术切除的肾癌患者。其中男33例，女34例，年龄36～82（平均54±18.5）岁。按国际抗癌联盟(1987年)，TNM分期：其中I期4例，Ⅱ期27例，Ⅲ期30例，Ⅳ期6例。全部患者均经手术及病理证实。所有患者术前均未行放、化疗，手术标本取材后立即放人液氮罐保存。肾癌临床分期标准根据肾壁增厚程度及是否外侵、有无远处转移，可将肾癌分为4期，Ⅰ期(即早期)

4、：腔内肿块或局限性肾壁厚(3～5mm)；Ⅱ期：肾壁厚＞5mm，但未侵及纵隔，也无远处转移；Ⅲ期：肾壁厚＞5mm，侵犯周围组织，也可以有纵隔淋巴结肿大，但无远处转移；Ⅳ期：肾壁厚＞5mm，不但侵犯周围组织，且有远处转移。1.2方法1.2.1ELISAMMP2、MMP9和VEGF抗体和酶联免疫吸附法试剂盒购自福建迈新生物科技发展有限公司。液氮罐保存肾癌组织按2.5ml/g质量加入相当体积的冰生理盐水，用匀浆器将组织研磨，然后在冰浴下超声波粉碎制成匀浆，4℃，10000r/min离心10min，取上清液。实验严格按照MMP2、MMP9和VEGF酶联免疫吸附法说明书步骤进行。1.

5、2.2MP2、MMP9、VEGF含量。按10ml/g的比例加入全细胞裂解液，组织经匀浆、超声破碎后，用二喹啉甲酸（BCA）法进行蛋白定量。10％的十二烷基硫酸钠聚丙稀酰胺凝脑电泳（SDSPAGE）法上样量为28μg。电泳条件:4℃。电流20～30mA。电泳结束后，进行蛋白质转膜。转膜条件：采用孔径为0.22m的硝酸纤维素膜(NC)，4℃,电流400mA，转膜3h。BP(1∶1000)杂交反应3h，吐温20/Tris盐酸缓冲液（TTBS）漂洗同前。再将NC膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶5000)杂交反应1h。最后用TTBS漂洗NC膜3次，每次10min，加入EC

6、L试剂反应5min，保鲜膜包裹，暗室X光胶片曝光、显影和定影。然后同一张NC膜再与βactin(1∶1000)进行MP2、MMP9和VEGFPCR引物设计见表1(北京奥科生物科技有限公司)。将PCR扩增的产物5μl在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，电压一般为70～80V。电泳完毕后，取出凝胶在紫外灯下观察结果并照相。结果用QuantityOne4.4.0软件行定量分析，以目的基因与βactin条带平均光密度比值表示目的基因mRNA的相对表达量。表1MMPs和VEGFPCR引物设计1.3统计学处理数据以x±s表示，采用SPSS11.0软件包进行统计学处理，组内不同时相点的比

7、较采用方差分析，组间同一时相点的比较采用t检验，OneRNAMMP2/MMP9和VEGF的表达水平与蛋白质表达水平结果也具有一致性，MMP2/MMP9和VEGF在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期肾癌组织中明显表达，尤其Ⅳ期肾癌组织中表达最明显(P＜0.01)。图2和表4。表4mRNA水平比较MMP2/MMP9和VEGF的表达3讨论ECM是肿瘤转移的主要屏障。MMPs是降解ECM最重要的酶类。MMPs活性上调与肿瘤侵袭、转移有关。金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs作为MMPs的天然抑制物，可