重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达

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1、重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达【关键词】,血管抑制素类Constructionofrebinanthumanangiostatinexpressionvectorandstableexpressiononhumanhepatocelluarcancercells　　【Abstract】AIM:Toconstructtherebinanthumanangiostatin(hANG)expressionvectorandtodetectitsexpressioninhepatocellularcarc

2、inomacells.METHODS:hANGcDNAfragmenthumanembryonictissueandthefragmentedigestionandsequencingent.TherebinantpcDNA3.1hANGplasmidacellstodetecttheexpressionofhANGinthesecells.RESULTS:TheobtainedhANGfragment(1.1kb)anangiostatin.Restrictionenzymedigestiondemonstrated

3、thattherebinantpcDNA3.1hANGexpressionvectora,hepatocellular;angiogenesis;expressionvector　　【摘要】目的：构建重组人血管抑素（hANG）的表达载体并检测其在肝癌细胞系中的稳定表达.方法：利用RTPCR从人胚胎肝组织中扩增出hANGcDNA片段，将其克隆到pCRBluntIITOPO载体和pcDNA3.1(+)表达载体，利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段及重组载体进行验证.将重组pcDNA3.1hA

4、NG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC7721对其表达状况进行检测.结果：所获得的hANG片段（1.1kb）序列与报道的序列完全一致.酶切鉴定的结果表明含血管抑素基因的重组pcDNA3.1hANG表达载体构建成功.转染重组pcDNA3.1hANG的人肝癌细胞SMMC7721表达了血管抑素.另外，从生长曲线结果来看，转染pcDNA3.1hANG真核表达载体和空载体的人肝癌细胞SSMC7721和未转染的SSMC7721细胞的生长速度无明显差别.结论：成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSM

5、C7721肝癌细胞，为开展下一步的实验奠定了基础.　　【关键词】血管抑制素类；癌，肝细胞；血管生成；表达载体　　0引言　　原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，以往的实验研究多数针对肿瘤细胞本身，但瘤细胞具有遗传不稳定性、高突变率和高异型性等特点，因此未能取得满意的疗效.肝癌具有双重血液供应系统，是体内最富有血管的肿瘤之一，抗血管生成治疗将为原发性肝癌的治疗提供一个新的途径.　　血管抑素（angiostatin,ANG）是近年来发现的最有效的血管生成抑制因子之一，它特异性地作用于血管内皮细胞，通过抑制血管生成实现抑制肿瘤

6、的生长和转移，是肿瘤基因治疗中非常有用的目的基因［1］.但是，血管抑素抑制肿瘤血管生长的机制还不清楚.在既往的实验中我们观察了鼠源性ANG在肝癌细胞系中的表达［2］.为了使研究结果更贴近临床实际，我们构建了重组人血管抑素（humanangiostatin,hANG）表达载体，利用体外实验方法观察了重组hANG在肝癌细胞系中的稳定表达，为将来进一步开展血管抑素抑制肝癌生长的机制研究奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　pCRBluntIITOPO载体,pcDNA3.1(+)载体,Trizol,和Superscrip

7、tII反转录酶购自Invitrogen公司.DNA凝胶回收及质粒提取试剂盒购自Qiagen公司.TaqDNA聚合酶购自Takara公司.PfuTurboDNA聚合酶购自Stratagene公司.脂质体转染试剂盒购自Gibco公司.ECL化学发光试剂盒(RPN2109)购自Amersham公司.人源性肝癌细胞株SMMC7721为本室保存.引物由上海Sangon公司合成.　　1.2方法　　1.2.1PCR扩增hANG基因片段人胚胎肝脏组织取自我校西京医院妇产科人工流产胚胎，取得患者同意.组织（约80mg）取出后，加入1mL

8、TRIzol试剂按试剂盒说明书提取总RNA.利用SuperscriptII反转录酶合成cDNA第1链.根据报道的hANG的cDNA序列合成上游及下游引物.上游引物：5′TCAGAGTGCAAGACTGGGAA3′；下游引物：5′ACAGGCGGAGGTGCTACAAC3′.扩增产物长度为1100bp，包含人纤溶酶原（plasmin