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1、人TGFBI基因克隆及真核表达载体的构建作者：葛红岩 于旭辉 尚巍 赵秀梅 张璐 高维奇 刘平【摘要】 目的:克隆人TGFBI基因,并构建其真核表达载体。方法:通过RT-PCR从供体角膜移植术后留下的角膜组织中克隆人TGFBI基因全长编码区，将该DNA片断亚克隆到克隆载体pMD18-T中，进一步通过和SalI双酶切将目的片断定向克隆至真核表达质粒载pCI中。经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果:获得了人TGFBI的编码基因，并成功建了其真核表达载体。结论:人TGFBI基真核表达质粒的成功构建并鉴定。【关键词】TGFBI 角膜营养不良
2、 真核表达 CloningofhumanTGFBIgeneanditseukaryoticexpressionplasmidconstructionAbstractAIM:ToclonehumanTGFBIgeneandconstructitseukaryoticexpressionplasmid.METHODS:ThefullcodingdomainsequenceofTGFBIgenehumancornealtissuefromoperativespacemanerasechainreaction(RT-PCR)andent,digest
3、edeXbaIandSalI,idpCI.Thenthereconstructedplasmidedigestionandsequencing.RESULTS:HumanTGFBIgeneplifiedanditseukaryoticexpressionplasmididcontaininghumanTGFBIgeneestablishedthefoundationofstudyingofthemechanismsofTGFBIgenemutationrelatedcornealdystrophy.·KEY1SI，GSN等[1]。同时已经认识到
4、，在中国以TGFBI基因突变导致的角膜营养不良最常见,其多为青春期发病，累及双眼且对称性，病变进展缓慢，导致角膜明显混浊，引起视力下降。至今为止，该病的致病机制仍不十分清楚。TGFBI基因突变导致的细胞信号传导通路的异常激活是近年来研究的热点，受到越来越多的关注。成功获得人TGFBI基因并构建其真核表达载体是研究角膜营养不良的发病机制的重要物质基础。1材料和方法1.1材料收集2006-01/12在我院行穿透性角膜移植手术供体残留的角膜组织。pCI载体和感受态大肠杆菌JM109由本实验室保存。PMD18-T载体为Takara公司产品。RT-PCR
5、试剂盒和Trizol试剂为Invirogen公司产品;TaqDNAPolymerase,限制性内切酶（和SalI），DNAmarker均为Takara公司产品；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒为上海华瞬公司产品；T4连接酶为NeetrGenAmpPCRsystem2400）。1.2方法根据GeneBank上报道的人TGFBI序列（NM_000358）,利用软件Oligoprimer5辅助设计克隆TGFBI基因的上、下游引物，由上海英俊生物有限公司合成。上游引物hTGFBIF：5′TATATGTAGAGCCAGCATGGCGCTCTTC-GTGCG３
6、′,下游引物HtgfbiR：５′GTGCGTCGACCGTAA-TGCTTCATCCTCTC３′。上游引物Ｆ的５′端设有酶切位点，下游引物R的５′端设有SalI酶切位点。PCR产物为2089bp。取人角膜缘组织300mg,加入Trizol试剂3mL,匀浆器匀浆。转入DEPC7mL处理过的EP管,室温放置5min后,4℃，12000ｇ,离心10min。加入氯仿0.6mL,用力混匀，室温放置3min后,4℃,12000ｇ,离心15min。取上清，加入异丙醇1.5mL，室温放置10min后,4℃，12000ｇ,离心10min。弃上清，加750g/L乙
7、醇3mL，振荡混匀,4℃,9000ｇ，离心5min。弃上清，空气干燥后，加入DEPC20μL处理水溶解。根据Takara两步法RT-PCR试剂说明，建立反转录体系40μL。向上步总RNA20μL中，加入oligo.dT5μL,70℃水浴5min后，立即放在冰上2～3min。继续加入RNA酶抑制剂1μL，5×RTBuffer8μL，25mmol/LdNTP4μL，0.1mol/LDTT4uL，200kU/LM-MLV1μL，混匀，37℃水浴3～4h。以反转录产物为模板，建立克隆TGFBI基因PCR反应体系，反应体系为50μL。其中模板1μL，25
8、mmol/LdNTP4μL，上、下游引物各2μL，5kU/LExTag酶0.3μL，10×ExTagBuffer5μL。反应条件为预变性为95℃5mi
