枸骨内生真菌抗菌活性成分的分离、鉴定与应用分析

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1、·独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果。对本研究做过贡献的老师和同学均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。日期：2009年6月1日关于论文使用授权说明本人完全了解杭州师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅;学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。日期：2009年6月1日····杭州师范大学枸骨内生真菌抗菌活性成分的分离、鉴定及应用研究摘要本论文通

2、过系统筛选，从植物枸骨（LlexcornutaLindl.）中分离到的一株具有高抗菌活性的内生真菌，并以此作为研究对象，对该内生真菌进行了种属鉴定，并对其代谢产物中主要活性成分进行了提取、分离和结构解析；在此基础上研究了主要活性成分的分析检测方法和抑菌作用，通过紫外诱变选育出高效活性生产菌株，运用随机扩展多态性DNA（RAPD）技术对该菌及其诱变体进行DNA多态性分析，最后对活性成分的安全性和药效进行了评价。主要研究结果如下：（1）枸骨内生真菌的属种鉴定：根据形态培养特征和生理生化特征，对照《真菌鉴定手册》将该内生真菌初步归属为木霉属真菌哈茨木霉（Trichoder

3、maharzianumRifai），将其命名为哈茨木霉菌株L。（2）哈茨木霉菌株L的代谢产物的主要抗菌活性成分：分离纯化得到哈茨木霉菌株L代谢产物的主要抗菌活性成分，经IR、MS和NMR光谱分析确定为一倍半萜类化合物，英文名称为：trichodermin，化学名称：4β-乙酰基-12，13-环氧-9-单端孢霉烯。并且建立了该物质的气相色谱分析方法。（3）活性物质trichodermin的抑菌活性：室内毒力测定结果表明，Trichodermin对9种植物病原真菌的菌丝生长和2种植物病原真菌孢子的萌发均有不同程度的抑制作用。其中对水稻纹枯病菌[Thanatephorus

4、cucumeris（Frank）Donk]和黄瓜立枯病菌（RhizoctoniasolaniKüehn）有较好的毒力，其EC50值分别为0.7071μg/mL和0.3253μg/mL；对番茄灰霉病菌（BotrytiscinereaPers）和番茄早疫病[Alternariasolani（EllisetMartin）JonesetGrout.]，毒力作用次之，其EC50值分别为3.7287μg/mL和10.6772μg/mL；对黄瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinumOwen）、西瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporium

5、f.sp.niveum）、菜豆炭疽病菌[Colletotrichumlindemuthianum（sacc.etMagn.）Br.etCav.]和葡萄炭疽病菌[Colletotrichumgloeosporioides（Penz.）Sacc.]的毒力相对较弱，其EC50值分别为23.4072、41.6013、33.0261和28.6393μg/mL；对水稻胡麻斑病菌[Cochliobolusmiyabeanus（Ito&Kuribayashi）]的毒力最差（>800μg/mL）。对黄瓜枯萎病菌（F.oxysporumf.sp.cucumerinum）和西瓜枯萎病菌（

6、F.oxysporiumf.sp.niveum）孢子萌发的抑制作用EC50分别为2.2209和2.2905μg/mL。活体试验结果表明，Trichodermin浓度为100mg/L时，对番茄早疫病（A.solani）及黄瓜立枯病（R..solani）的保护效果达97.8%和98.1%，治疗效果达96.7%和97.3%。（4）Trichodermin制剂的药效、安全性及毒理学研究：盆栽试验结果表明，Trichodermin1000倍液对黄瓜立枯病（R..solani）有良好的治疗和保护作用，7天后保护防效和治疗防效分别为88.89%和95.83%；Trichoderm

7、in在番茄及土壤中降解较快，残留极低，施药后的第10天trichodermin在番茄中的残留量仅0.0054mg/kg，在土壤中的残留量仅为0.0013mg/kg；Ⅰ····杭州师范大学枸骨内生真菌抗菌活性成分的分离、鉴定及应用研究经毒理学研究发现，Trichodermin原药产品对哺乳类动物十分安全，按GB15670-1995《农药登记毒理学试验方法》的分级标准该农药的原药属低毒。（5）高效菌株的选育及诱变前后菌株RAPD分析：以哈茨木霉菌株L作为出发菌株，进行紫外线二次复合诱变处理，通过初筛和复筛，获得一株高产突变株UV-5-3，其产素水平为164.75μg