《饲料中大肠杆菌O157的快速检测 EMA-PCR法》河南省地.doc

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1、《饲料中大肠杆菌O157的快速检测EMA-PCR法》河南省地方标准编制说明一、编制的目的和意义大肠杆菌O157属于致病性大肠杆菌的一种，它产生的志贺样毒素能引起出血性肠炎，主要感染5岁以下的儿童，主要症状有剧烈性的腹痛和便血，严重者出现溶血性尿毒症。近年来，大肠杆菌O157可谓劣迹斑斑，自1982年美国在因食用汉堡引起食物中毒的病人粪便中分离出大肠杆菌O157以来，多个国家都曾发生过由它引起的爆发流行。1996年在日本的爆发的一起由O157引起的食物中毒事件，从冈山、广岛等县几十所中学和幼儿园相继发生集体食物中毒

2、事件开始，到波及范围达44个都府县9000多人发病，导致19人死亡，上百所学校停课。我国在1988年首次分离到大肠杆菌O157，至今以来多以散发为主。据统计，由大肠杆菌O157导致的爆发流行，食源性的占71%、接触感染占16%、水源性污染占12%。因此，对大肠杆菌O157建立快速、特异、灵敏的检测标准对于该菌的早期发现及疫情的有效控制至关重要。目前大肠杆菌O157的检测方法较多，主要有传统的分离鉴定、免疫学方法、以及分子生物学方法。传统培养方法，检测时间需要一周左右，费时费力；免疫学方法由于血清学较多，容易出现交

3、叉污染；分子生物学方法虽然快速，灵敏，但不能有效区分死菌与活菌。本研究以大肠杆菌O157菌体抗原特异性基因rfbE序列为靶基因设计一对引物，采用EMA与PCR结合的方法进行检测，能够有效地区分大肠杆菌O157的死菌与活菌，避免了因死菌DNA存在造成的假阳性结果，同时减去了传统培养方法中目标菌分离纯化的步骤，节约了大量检测时间。本次研究结果显示，PCR检测大肠杆菌O157的灵敏度在1.2×102cfu/mL左右，从预增菌、样品处理、PCR扩增、凝胶电泳只需要48h左右，与传统培养学方法相比，稳定性好、灵敏度高、特异

4、性强，可用于检测饲料中大肠杆菌O157的污染状况，对饲料的安全监测具有重大意义。二、任务来源及编制原则和依据1、任务来源根据河南省质量技术监督局文件《河南省质量技术监督局关于下达2017年第一批河南省地方标准制修订计划的通知》（豫质监标发〔2017〕104号）的要求，由河南省兽药饲料监察所负责对河南省地方标准《饲料中大肠杆菌O157活菌的检测EMA-PCR法》（立项编号：20171210480）的起草、制定工作。2、编制原则符合国家法律、法规和政策，本着严格遵循科学依据，与国际水平接轨，并且准确、实用、快速的原则

5、，开展了本次研究工作。3、编制依据主要依据以下标准：GB4789.6食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验；SN/T1059.5食品和动物饲料大肠杆菌O157的检测方法免疫磁珠法；GB19489实验室生物安全通用要求；GB4789.28食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求。三、编制过程标准的编制过程分三个阶段进行：第一阶段：大肠杆菌O157活菌EMA-PCR检测方法的建立1.引物设计参考已发表的文献，从GeneBank下载大肠杆菌O157的rfbE基因序列。根据该基因中的保守且特异性序列，设计扩增318bp大小的

6、特异性引物对。表1引物序列引物序列片段大小上游5'-CAGGTGAAGGTGGAATGGTTGT-3'318bp下游5'-CTCTTTCCTCTGCGGTCCTAGTTA-3'2.EMA-PCR方法参数的优化首先是探索大肠杆菌O157培养物的最佳致死方法和EMA最佳终浓度，分别采用煮沸裂解、紫外照射及化学方法对培养物进行处理，再分别加入EMA，制备成EMA终浓度成梯度变化的菌悬液，采用卤素灯进行光照交联。然后通过离心收集上清液，进行PCR扩增，观察凝胶电泳结果，选出最优的致死方法和最佳EMA添加终浓度。其次是最佳

7、曝光时间的确定，在上述试验的结果上，选出最优组合，采用卤素灯下分别照射0、1、2、4、6、8、10min，离心收集上清液，进行PCR扩增。1.确定方法的灵敏度和特异性。4.用建立的大肠杆菌O157EMA-PCR方法检测饲料及饲料原料样品，并与GB4789.6《食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》和SN/T1059.5《食品和动物饲料大肠杆菌O157的检测方法免疫磁珠法》进行对比，以验证该方法的实用性和准确性。第二阶段：大肠杆菌O157EMA-PCR检测方法应用实验本阶段主要进行大肠杆菌O157EMA-PCR检测

8、方法在河南省范围内的应用实验。为了进一步验证所建立的诊断方法的特异性、敏感性和实用性，由河南省兽药饲料监察所进行饲料样品检测应用实验。共对来自全国4个省（大部分样品来自河南省）共计216批饲料及饲料原料样品进行了应用检测；结果未检出阳性样品。同时与GB4789.6《食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》和SN/T1059.5《食品和动物饲料大肠杆菌O157的检测方法免疫磁