蛋白免疫印迹杂交

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时间:2018-12-26

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1、蛋白免疫印迹杂交(WesternBlot)技术手册·蛋白免疫印迹杂交(WesternBlot)技术手册 蛋白免疫印迹杂交(WesternBlotWB)是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离,再转移到杂交膜(blot)上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。本指南讨论WesternBlot操作方法及常见问题分析,有助于成功完成WB。   A蛋白样本提取制备     1细胞或组织裂解     2蛋白酶和磷酸酶抑制剂     3蛋白定量     4电泳

2、上样样品的准备B 电泳  1PAGE胶的制备 2蛋白分子量Marker 3阳性对照 4内参对照 5上样与电泳C 转膜与显色(WesternBlot) 1胶中蛋白的检测 2蛋白转膜 3膜上蛋白的检测:丽春红 4膜的封闭 5一抗的孵育 6二抗的孵育7显色 D常见问题分析与解决方案 附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制                       WB概述: 检测原理:  A蛋白样本提取制备  蛋白样品制备是WesternBlotting的第一步,更是决定WB成败的关键步骤,  总

3、体原则和注意事项:  1:尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白(通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品)2:保持蛋白的处于溶解状态(通过裂解液的PH盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择)3:提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等,(低温操作,加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂)4:尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子(通过加入核酸酶或采取不同提取策略)5:样品分装,长期于-80℃中保存,避免反复冻融。 A-1细胞或组织裂解      A-1-1细胞裂解       裂解液Lysisbuffer或商品化蛋白

4、抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysisbuffe推荐试剂盒全细胞NP-40orRIPA(附录1)全蛋白抽提试剂盒细胞质(可溶蛋白)Tris-HCl(附录1)胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质(细胞骨架等不溶蛋白)Tris-Triton(附录1)蛋白分级抽提试剂盒细胞质(磷酸化蛋白) 磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40orRIPA(附录1)膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA(附录1)核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA(附录1)线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细

5、胞裂解操作方法:1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次,裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂(种类与量见本节2)2 吸净PBS,加入预冷的裂解液,((1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask;0.5mlper5x106cells/60mmdish/75cm2flask).3 用细胞刮子刮取贴壁细胞,将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中,4        4℃摇动30min5        4℃离心12,000rpm,20min(根椐细胞种类不同调整离心力)6 轻轻吸取上清,转移至新

6、预冷的微量离心管中置于冰上,即为蛋白样本,弃沉淀. A-1-2组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织,尽量置于冰上以防蛋白酶水解,  2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中,加入液氮冻结组织于冰上均质研磨,长期可保存于-80°C,3 每约5mg加入约300μl预冷的裂解液lysisbuffer,冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时,裂解液体积与组织样本量有适当比例,(最终的蛋白浓度至少达到0.1mg/ml,理想的蛋白浓度应为1-5mg/ml).4 4℃离心12,000rpm,20min,轻轻吸取上清

7、,转移至新预冷的微量离心管中置于冰上,即为蛋白样本,弃沉淀, A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂 推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL,或按下表配制: 备注:其中Sodiumorthovanadate配制活化方法如下:  所有步聚均需在通风橱中进行:1.用双蒸水配制100mM正矾酸钠溶液.2.用盐酸HCl调至pH9.03.煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发.4.冷却至室温5.再调pH至9.06.再煮沸至无色7.重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH9.08.用水定容至原体积9.分装保存于-20°C.溶

8、液变黄则弃之不用. A-3 蛋白定量Bradford法Lowry法或BCA法(均有商品化试剂盒可选择,操作简单、需分光光度计或酶标仪),小牛血清白蛋白(BSA)作为标准曲线。如果裂解液中有NP40或其它表面活性剂,则推荐使用BCA法。三种方法或产品比较列表如下:方法原理灵敏性干扰因素应用Lowry法Folin-酚试剂法蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+螯合,形

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