大鼠epo真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

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1、大鼠EPO真核表达载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达王文益王文益，男,（1981.3-），四川资阳人，汉族，硕士，医师，工作单位为四川省三台县人民医院儿科。E-mail：xuehaitianshu@163.com手机15909360211赵聪敏通信作者赵聪敏教授，第三军医大学第二附属医院儿科主任医师硕士研究生导师。电话：(023)68774602E-mail：zhao_54@163.com基金项目：重庆市科委项目（CSCT,2007BB5057）；重庆市计生委项目（2009C175）廖伟(第三军医大学新桥医院儿科，重庆4000

2、37)摘要:目的　构建表达大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的真核表达质粒pEGFP-N1/EPO,并检测其在体外的表达,为治疗缺氧缺血性脑病引起的脑损伤提供实验基础。方法　从大鼠肾脏获得EPO基因片段并用RT-PCR方法扩增,将其连接于真核表达质粒pEGFP-N1,测序鉴定后,用脂质体包裹转染大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSCs）,采用免疫组化和RT-PCR检测EPO的表达。结果　经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染大鼠MSCs细胞后可表达E

3、PO蛋白。结论　成功构建的pEGFP-N1/EPO重组质粒能在体外表达EPO蛋白。关键词：促红细胞生成素；真核表达载体；骨髓间充质干细胞；缺氧缺血性脑病ConstructionofeukaryoticexpressionplasmidvectorpEGFPN1-EPOanditsexpressionvitroWangWen-Yi,ZhaoCong-Min，LiaoWei(Departmentofpediatrics,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,40

4、037)Abstract:Objective　ToconstructeukaryoticexpressionplasmidvectorpEGFP-N1/EPO,andtodetecttheexpressionoftheplasmidinvitro,whichisthebasisforfurtherstudyonthetreatmentofHIBD(hypoxic-ischemicbraindamage).Methods　wegainEPOcDNAfragmentoftherat’skidney,amplifiedbyRT-PCR,a

5、ndinsertedintopEGFP-N1(-)vector,thenidentifiedbyrestrictionendonucleasedigestionandnucleotidesequencing.MSCscellsweretransfectedwiththeplasmidusingLipofectamine2000.TheexpressionofEPOproteinwasdetectedbyimmunohistochemistrytechniquesandRT-PCR.Results　Theconstructedreco

6、mbinantplasmidcontainedthesequenceofrat’sEPOgene.Aftertransfectionwiththeplasmid,EPOproteincouldbeexpressedinMSCscells.Conclusion　TheconstructedeukaryoticexpressionplasmidvectorpEGFP-N1/EPOcanexpressEPOinvitro.Keywords:EPO;erythropoietin;eukaryoticexpressionplasmid;MSC

7、s;HIBDEPO是是一种耐热的含唾液酸的酸性糖蛋白,能促进造血祖细胞的增殖分化。近年来发现其具有阻断兴奋性氨基酸的毒性、抗神经细胞凋亡、抑制炎症反应、促进新生血管形成等效应，在脑损伤的神经保护中起重要作用，已成为脑保护研究中的热点之一。因此，我们将大鼠EPOcDNA片段连接到pEGFP-N1（-）载体上，拟构建真核表达载体pEGFP-N1/EPO，为进一步探讨EPO对HIBD大鼠的基因治疗及生物学行为改善打下实验基础。1材料与方法1.1主要材料克隆宿主菌E.coliCompetentCellsJM109、和克隆载体质粒pEGFP-

8、N1(-)(卡那霉素抗性)（由安晓静博士惠赠）购自Invitrogen公司？、RNAreagent反转录酶、琼脂糖、引物、HighFidelityPrimeScriptTMRT-PCRKit、PrimeSTARHSDNAPolymer