pgex―4t―1―neurexin 1β原核表达载体构建及表达条件的优化

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1、pGEX―4T―1―Neurexin1β原核表达载体构建及表达条件的优化　　【摘要】目的：构建Neurexin1β（Nrx1β）原核表达重组体。方法：以pcDNA3.1-Myc-Nrx1β真核表达载体为模板，经PCR扩增Nrx1β目的基因，然后将其亚克隆入pGEX-4T-1载体，构建其原核表达载体，转化入宿主菌BL21，选用IPTG进行诱导表达，优化表达条件，SDS-PAGE检测Nrx1β的蛋白表达。结果：Nrx1β目的基因扩增成功，经克隆后成功连接至pGEX-4T-1，重组体酶切结果及测序结果与预期结果一

2、致。转化入BL21后在IPTG的作用下成功表达，且在24°C时，IPTG浓度为0.2mmol/L诱导12h后Nrx1β的蛋白表达量最高。结论：该研究成功构建了pGEX-4T-1-Nrx1β原核表达载体，并优化了Nrx1β的蛋白表达条件，为下一步研究该蛋白质的功能奠定基础。　　【关键词】Neurexin1β原核表达载体表达条件　　【Abstract】Objective：ToconstructtheprokaryoticexpressingplasmidrecombinantforNeurexin1β（Nrx1

3、β）.Method：Nrx1βcDNAwasobtainedbyPCRfrompcDNA3.1-Myc-Nrx1βeukaryoticexpressionvector，andclonedintothepGEX-4T-1vector.ThepositiveprokaryoticexpressionvectorwastransformedintoEscherichiacoliBL21.TheexpressionofNrx1βwasinducedbyIPTGwithopticalconditionandwasde

4、tectedbySDS-PAGE.Result：Gene9ofNrx1βwassuccessfullyamplified，andthePCRproductwasligatedintopGEX-4T-1.Resultsofrestrictionenzymedigestionandsequencingwereconsistentwithexpectations.AftertransformingintoBL21，theproteinexpressionwassuccessfullyinducedbyIPTG.C

5、onclusion：ThestudyconstructedNrx1βprokaryoticexpressingplasmidrecombinantsuccessfully，andoptimizedtheproteinexpressionofNrx1β，whichprovidethefoundationforstudyingtheroleofNrx1βinnervoussystem.　　【Keywords】Neurexin1β；prokaryoticexpressingvector；expressioncon

6、dition　　1引言　　Neurexin（Nrx）是一种突触前膜蛋白，他们大多定位于突触前膜并含有一个跨膜结构域。其胞外结构域主要在突触间隙与其他蛋白质结合发挥作用，使神经元之间相互联系并形成突触[1]。在哺乳动物中，Nrx是由三个不同的基因（nrx1，2，3）分别由两个不同的启动子（上游α和下游β）转录为α-nrx1-3及β-nrx1-3，并最终翻译为Nrx1α-3α及Nrx1β-3β[2]。　　Nrx最初是作为α-latrotoxin受体而被发现，α-latrotoxin与突触前受体Nrx结合并诱导大

7、量神经递质的释放[3]。目前已报导的能与Nrxs发生相互作用的蛋白有neuroligins，leucine-richrepeatpeoteins（LRRTMs），latrophilin，neurexophilins，synaptotagmins，9Cbln1-GluD2复合物等[4-9]。随着人们对Nrx的深入研究，发现Nrx与其受体相互作用后，参与细胞识别和细胞黏附，介导细胞信号转导，在突触形成及突触传递中发挥了重要作用，且通过突触的特异性影响神经网络的性能[4，10，11]。尽管如此，Nrx在突触发生形

8、成和突触传递中的作用机制仍未完全阐明。因而对于Nrxs的功能和作用机制需要进行深入细致的研究。　　pGEX-4T-1是目前在生命科学领域中研究较广泛的原核表达载体。本研究通过分子生物学手段成功构建了pGEX-4T-1-Nrx1β原核表达载体，并获得Nrx1β表达蛋白，为今后研究Nrx1β的结构和功能提供参考。　　2材料与方法　　2.1材料　　2.1.1质粒及菌株　　pcDNA3.1-Myc-Nrx1β真核表达载体