《GBT14929.5-1994-谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定方法》.pdf

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1、中华人民共和国国家标准谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌GB/T14929.5-94烯醇的测定方法Methodfordeterminationofdeoxynivalenolincerealandcerealproducts━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━1主题内容与适用范围本标准规定了谷物及其制品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法及免疫测定法(ELISA)的基本要求。本标准适用于谷物(小米、玉米、大麦等)及其制品(蛋糕、饼干、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。第一法的最低检

2、出浓度为0.1mg/kg。第二法的最低检出浓度为0.1ng/kg。第—篇薄层色谱测定法2原理谷物及其制品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在365nm紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。3试剂以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。3.1三氯甲烷。3.2无水乙醇。3.3甲醇。3.4石油醚(60～90℃或30～60℃)。3.5乙酸乙酯。3.6乙腈。3.7丙酮。3.8异丙醇。3.9乙醚。3.10无水乙醚。3.11氯化铝(AlCl3·6

3、H2O):化学纯。3.12中性氧化铝:层析用，经300℃活化4h，置干燥器中备用。3.13活性炭:20g活性炭，用3mol/L盐酸溶液浸泡过夜、抽滤后，用热蒸馏水洗至无氯离子，在120℃烘干备用。3.14硅胶G:薄层层析用。3.15脱氧雪腐镰刀菌烯醇(以下简称DON)标准溶液，精密称取5.0mgDON，加乙酸乙酯-甲醇(19:1)溶解。转入10mL容量瓶中，用乙酸乙酯-甲醇(19:1)稀释至刻度，此标准溶液含DON0.5mg/mL。吸取此标准溶液0.5mL，用乙酸乙酯-甲醇(19:1)稀释至10mL，此溶液每毫升含DON25μg。4仪器4.

4、1小型粉碎机。4.2电动振荡器。4.375mL玻璃蒸发皿。4.4层析柱:内径2cm，长10cm，不具活塞。4.510mL具塞浓缩瓶：底部具0.2mL刻度尾管。4.6玻璃板:5×20cm。4.7薄层涂布器:0.3mm。4.8展开槽：内长25cm，宽6cm，高4cm。4.9紫外光灯：365nm。4.10微量注射器:10μL、50μL。4.1150mL平底管。4.12双波长薄层扫描仪:带数据处理机。5分析步骤5.1提取称取20g粉碎样品置于200mL具塞锥瓶中，加8mL水和100mL三氯甲烷-无水乙醇(8:2),密塞。在瓶塞上涂层水，盖严防漏，振

5、荡1h，通过折叠快速定性滤纸过滤，取25mL滤液于75mL玻璃蒸发皿中,置90℃水浴上通风挥干。5.2净化5.2.1液-液分配5.2.1.1谷物:用50mL石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入100mL分液漏斗中，再用20mL(玉米样品用30mL)甲醇-水(4:1)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中。5.2.1.2谷物制品(蛋糕、饼干、面包等):用100mL石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入250mL分液漏斗中，再用30mL甲醇-水(4:1)分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中。振摇分液漏斗1.5min,静置约15min,使分层后,将下层甲醇-

6、水提取液过柱净化，不要将两相交界处的白色絮状物放入柱内。5.2.2柱净化5.2.2.1小麦及其制品:在层析柱下端与小管连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面。再加入0.4g活性炭，敲紧。将层析柱下端小管插入一橡皮塞，塞在抽滤瓶上，抽滤瓶中放一平底管接受过柱液，将抽滤瓶接上水泵或真空泵，稍稍开启泵，使活性炭压紧，将分液漏斗中的甲醇水提取液小心地沿管壁加入柱内，控制流速为每15s18～20滴(3mL/min)，甲醇-水提取液过柱快完毕时,加入10mL甲醇-水(4:1)淋洗柱，抽滤，直至柱内不再有液体流出。过柱速度

7、控制在2～3mL/min，速度太快净化效果不好，太慢耗时太长。5.2.2.2玉米:同5.2.2.1，只是将活性炭的用量改为0.3g。5.3制备薄层层析用样液将过柱后的洗脱液倒入75mL，玻璃蒸发皿中,用少量甲醇-水(4:1)洗涤平底管。将蒸发皿置沸水浴上浓缩至干。5.3.1小麦:趁热加入3mL乙酸乙酯，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾将残渣中的DON溶出，并将乙酸乙酯挥发至干，再加入3mL乙酸乙酯同样处理一次，将溶剂挥干，最后加3mL乙酸乙酯，加热至沸，放冷至室温后转入浓缩瓶中,再用三份1.5mL乙酸乙酯洗涤蒸发皿，

8、并入浓缩瓶中。5.3.2小麦制品、玉米:趁热加入3mL乙酸乙酯，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾，将残渣中DON溶出,放冷至室温后转入浓缩瓶中,加约0.5