bim、p-akt蛋白在乳腺癌癌变中的表达及意义

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1、中国医科大学硕士学位论文Bim、p-AKT蛋白在乳腺癌癌变中的表达及意义姓名：赵静申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：宋敏20090301·中文论著摘要·Bim、p-Akt蛋白在乳腺癌癌变中的表达及意义．▲上-!圣刖吾Bim(Bcl-2interactingmediatorofcelldeath)是Bcl-2家族中仅含有一个BH3结构域的蛋白，具有助凋亡活性，广泛分布在机体各种组织，对防御自身免疫、维持造血细胞稳态有重要意义，并具有肿瘤抑制因子活性。不同的细胞Bim表达和功能的调节方式各异

2、，包括转录水平、亚细胞定位、磷酸化调节等。Bim转录水平调控十分复杂，可受到多种信号途径的调节，已报道的有MLK／JNK，P13K／AKT以及RAS／MAPK途径。现有许多研究表明P13K／Akt信号通路异常，与肿瘤的发生发展关系密切。本教研组的前期工作发现，P13K．Akt．Bad通路在乳腺癌的发生发展过程中有重要作用，Bim、Bad同属于BH3．only亚家族，那么在乳腺癌的发生发展中，Bim是否扮演着同样重要的角色，这对指导乳腺癌的临床诊断和治疗有重要意义。材料和方法1、材料人乳腺正常上皮细胞系MC

3、F．IOA、及人乳腺癌细胞系MCF．7、MDA—MB·231及MDA．MB一435S，30例新鲜乳腺癌组织及30例癌旁新鲜乳腺组织，101例乳腺组织取自于中国医科大学附属第～医院2001年1月至2007年5月手术切除标本。2、主要试剂兔抗入Bim多克隆抗体，兔抗人p-Aktl／2／3(Ser473)多克隆抗体，PDK／AKT特异性抑制剂LY294002均购自CellSignaling公司。WesternBlotting用二抗、兔抗人多克隆anti．p．actin抗体(PR．0255)、荧光二抗、HEST均

4、购自中山生物技术有限公司。RNA抽提试剂盒Trizol购自Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司，引物序列合成由TaKaRa公司完成。3、方法(1)免疫荧光方法检测Bim在正常乳腺上皮细胞系MCF．10A及人乳腺癌细胞MCF一7、MDA．MB．231／3乏MDA．MB一435S中的表达。(2)免疫组织化学(S—P)法检测Bim蛋白在乳腺各组病变组织中的表达。(3)WesternBlotting，RT-PCR分别检测Bim蛋白及BimmRNA在正常乳腺上皮细胞系及三种乳腺癌细胞

5、系中的表达。(4)WesternBlotting检测乳腺癌与癌旁乳腺组织中Bim、p-Akt蛋白的表达。(5)WesternBlotting检测用LY294002阻断P13K／AKT信号通路后乳腺癌细胞中Bim和P．AKT蛋白表达的变化。(6)采用SPSSl3．0统计学软件对WesternBlotting及ImPcR图像灰度值进行t检验和Pearson相关性检验，确定p

6、MDA—MB．231、MDA．MB．435S中都呈阳性表达。2、正常乳腺上皮细胞系MCF．10A中Bim蛋白及BimmRNA的表达均高于MCF一7、MDA—MB-231及MDA—MB．435S三．种乳腺癌细胞系，P值分另Up=O．003及P=0．009。3、Bim蛋白在乳腺导管内增生性病变及浸润性导管癌组织中阳性表达率逐渐降低，在乳腺普通导管增生与乳腺导管重度不典型及原位癌组间、重度不典型及原位癌和浸润性导管癌组间阳性表达率差异均具有统计学意义(p=O．026；p=0．014)。Bim蛋白表达与患者的临床

7、分期、淋巴结转移无明显关系，但与组织学分级有关p=D．∞3)，且组织学分级越低，Bim蛋白阳性表达率越低。4、Bim和P．Akt在30例乳腺癌组织和癌旁正常组织中均有不同程度的表达。其中Bim蛋白在癌组织中的表达明显低于对应的正常乳腺组织，平均灰度值2分别是0．322-q：0．138和0．591+0．130(p=O．OOO。p-Akt蛋白在癌组织中的表达明显高于对应正常乳腺组织，平均灰度值分别是0．710-J：0．219和0．412士0．115(p=o．002)。两种蛋白在乳腺癌组织中表达呈负相关性(，=

8、一0．489p=0．039)。5、将不同浓度的LY294002(0、10、25、50}tmol／L)加入培养液后24h，用WesternBlotting检测显示，乳腺癌细胞MCF．7中P．Akt蛋白水平下降，Bim蛋白表达水平升高(p