鸡新城疫病毒地方株的分离鉴定与其hn基因的克隆与序列分析

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1、摘要在河北保定地区两个鸡场中的发病鸡群中，分离到两株具有血凝性的病毒，经血凝试验和与多种阳性血清进行血凝抑制试验，确定两株分离株均为新城疫病毒，并分别表示为HBB和HBW。对此两株病毒的毒力进行了鉴定，测定鸡胚最小致死量平均死亡时间(MDT)分别为40．8h和53．7h：l闩龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)分别为1．93和1．86；6周龄鸡静脉内接种致病指数(IVPI)分别为2．89和2．72，结果表明：两株NDV分离株均为新城疫强毒株。器取10只12I=：={龄非免疫鸡进行攻毒试验，所有鸡只均在24小时内开始发病，其中HBB株在72

2、小时内对试验鸡致死率达100％；HBW株在120小时内致死率为80％；其余试验鸡则出现不可恢复性神经症状。对高母源抗体(HI效价≥61092)雏鸡进行攻毒试验，HBB株使试验鸡在192小时内全部死亡，致死率为100％；HBW株馒试验鸡在192小时内死亡4只，致死率为40％，其余耐过，均出现不可恢复性神经症状。结果表明：两株分离株对鸡均有很强的致病性，即使在高母源抗体存在条件下也能造成很高的发病率和死亡率，同时也证明了目前的传统NDV疫苗已不能有效保护现在流行强毒株的攻击，所以有必要针对本地区的毒株特点研制新的有效疫苗来防i}目酶新城疫的

3、流行。对两株新城疫病毒分离株进行大量增嫡，经透析膜浓缩后以TRNzol试剂法提取病毒RNA，参考文献报道的一对特异性引物，利用RT-PCR技术扩增其部分HN基因片段，将琼脂耱电泳检测为阳性的RT-PCR产物，纯化后连接到PBS-T载体中，经转化E．coliJMl09菌株进行克隆，选择白色阳性克隆菌落进行测序：应用DNAStar软件对上述两株NDV及国内外已发表新城疫代表株的HN基因的核苷酸片段及其相应的氨基酸序列进行比较并建立系统发育树。结果表明：两株病毒分别扩增出897bp的HN基因片段，编码299个氨基酸，两株病毒分离株HN基因核苷

4、酸序列同源性为99．7％，氨基酸序列之间的同源性为9913％，两株病毒HN基因核苷酸与国内外报道的相关序列同源性为82．8％～93，2％，推导氨基酸序列同源性为90．0％～96．0％，由系统发育树可见，本试验研究分离株与现今流行于国内的VII型病毒抹有密切联系。研究中发现HBB株与HBW株都属于新城疫病毒强毒株，两株病毒HN基因核苷酸之间有很高的同源性，但是HBB株的毒力和致病性却远大于HBW株。关键词：鸡：新城疫病毒；分离；HN基因；RT-PCRIsolation．IdentificationofNewcastleDiseaseVir

5、usandCloningandSequencingofItsHNGeneCandidate：LiJiefengSpecialty：PreventiveVeterinaryMedicineAdvisors：Professor．SunJiguoReseareher．XieChunfuAbstractTwoisolatesofviruswhichcouldagglutinatechickenredbloodeellwereisolatedfromtwodisease—infectedpoultryfarmsinBaodingofHebei．T

6、heseag目utinationswereinhibitedandneutralizedbyNewcastlediseasevirusstandardantisera．TheseisolateswereconfirmedtobeNewcastlediseasevirusbasedonHAandHItestandwerehamedbyHBBandHBW．Pathogenicityofthetweisolateswasjdentificated．Mearldeathtime(MDT)ofchickenembryosoftheseisolat

7、eswere40_8．53．7hseparately．Intracerebralpathogenicityindex(ICPI)oftheseisolatesinl-day—oldSPFchickenswere1．93，1．86，andIntracerebralpathogenicityindex(IVPl)oftheseisolatesin6-week—oldSPFchickenswere2．89and2．72Separately．Theresultsdemonstratedthatthetwoisolatesofviruswereh

8、i曲virulentNewcastlediseasevirus．1012一daychickens，whichwerenotimmunedbyNDV’werechallengedintheexperiment