腺病毒介导的ctla4ig基因对共同导入的bdnf基因在大鼠脊髓表达的影响

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1、目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一4研究论文腺病毒介导的CTLA4Ig基因对共同导入的BDNF基因在大鼠脊髓表达的影响前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8一丹IJ吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28讨论···········-····················-··································································31结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“35综述CTLA4Ig与免疫耐受⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··：⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·49个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50中文摘要腺病毒介导的CTLA4Ig基因对共同导入的BDNF基因在大鼠脊髓表达的影响摘要目的：脑源性神经营养因子(brain．derivedneurotrophicfactorBDNF)作为神经营养[](neurotrophicfactorsrcrF)家族的第二成员，是一种主要由脑组织合成、能够维持中枢神经系统多种神经元存活及促进神经轴突生长的碱性蛋白。BDNF基因在正常的大鼠脊髓中也有少量表达，当脊髓受损伤后局部的组织细胞表达BDN

4、F升高，可以促进脊髓神经元功能恢复，但表达量不稳定，时间较短。应用复制缺陷型重组腺病毒(AdenovirusAdV)为载体导入神经营养因子的基因治疗，已成为神经修复研究领域研究重点课题。但神经营养因子导入后机体往往将其看做为异体抗原引发免疫反应，成为应用神经因子基因治疗的影响因素之一。本实验将携带BDNF基因的AdV(AdBDNF)与不带外源基因的AdO或与携带细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(CytotoxicTlymphocyte-associatedantigen4immunoglobulin，CTLA4Ig)基因的AdV(AdC

5、TLA4Ig)两种腺病毒混悬液通过微量注射导入大鼠腰膨大脊髓实质内，比较两组BDNF基因在脊髓前角表达的情况，以探讨腺病毒介导的CTLA4Ig基因对共同导入的BDNF基因表达的影响。。方法：选用7周龄健康Wistar大鼠98只，体重200．2509。将大鼠随机分成三组：正常对照组(A组)为正常大鼠，不导入腺病毒；实验对照组(B组)导入Ad0+AdBDNF；实验组(C组)导入AdCTLA4Ig+AdBDNF。将实验对照组及实验组大鼠经腹腔注射氯胺酮／塞拉嗪麻醉(75．100mg／kg+5mg／kg)，麻醉成功后固定于脑立体定位仪上。取长约2c

6、m后正中切口，去除T13椎板，暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST．III型手动推进器，于脊髓后正中动脉右侧0．8mm处注射Ad0(5x109pfu／m11与AdBDNF(1×109pfu／m1)的混悬液2}d(B组)或AdBDNF(1X109pfu／m1)与AdCTLA4Ig(1X10ypfu／m1)2ul(C组)。针尖向头侧呈45度斜行进针，斜行刺入深度为2．5mm。注射速度为1山／rain，注射完毕后滞针5min，缓慢拔针。充分止血、冲洗伤口，局部中文摘要喷洒抗生素预防感染，关闭伤口。B、C组大鼠转染病毒后2天、4天、7天、15天

7、、30天、45天、60天取材，标本为大鼠脊髓。对三组大鼠脊髓进行厚40I-un的连续冰冻横切片经行免疫组织化学染色，计数三组中不同时间点BDNF在脊髓前角运动神经元染色阳性的细胞计数及BDNF免疫阳性产物积分光密度值(IoD)测定，采用免疫荧光染色检测AdCTLA4Ig持续表达时间并采用多聚酶链反应(PCR)监测B、C孤组病毒注入脊髓的存活时间，及逆转录多聚酶链反应(1玎．PCR)法检测三组BDNF基因在大鼠脊髓中表达的情况。结果：．1BDNF，CTLA4Ig的转基因表达1．1CTLA4Ig转基因表达：实验组术后两天可见到免疫阳性细胞，可持

8、续到术后45天随时间推移于术后60天无免疫阳性细胞出现。1．2BDNF转基因表达：在正常对照组(A组)，大鼠脊髓的腹角运动神动元和脊髓后角感觉神经元及部分胶质细胞中可见少量BDN