小反刍兽疫基因免疫研究论文

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1、摘要小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(PetedespetitSruminantsvirus，PPRV)感染引起的小反刍兽的一种急性或亚急性、烈性、接触性传染病，尤其是山羊和绵羊。该病以发热、眼鼻分泌物、胃炎、腹泻和肺炎为特征。根据该病毒与牛瘟、犬瘟热和麻疹病毒相似这一特性，将PPRV分类为副粘病毒科麻疹病毒属。该病毒由N／P瓜价／H／L六种蛋白组成，其中H、F蛋白在诱导宿主产生抗体过程中起了非常重要的作用，其中中和抗体主要与H蛋白有关。N蛋白虽然拥有比较好的免疫原性，也不能抵抗病毒，但可以用于诊断。该病于1942年在西非科特迪瓦首次报道。

2、在随后的10年内已经扩散到撒哈拉以南和赤道以北的多数非洲国家，以及中东到土耳其的几乎全部国家。2003年以后与中国西南边界接壤的国家均有爆发流行，给当地造成了巨大的经济损失。2007年7月小反刍兽疫在我国西藏阿里爆发流行。目前我国研制的商品化小反刍兽的重组疫苗和弱毒疫苗均不能有效的防治该病，且完全依赖进口。因此研究一种有效的新型基因工程国产化疫苗迫在眉睫。本研究通过对2007年7月从西藏m里的小反刍兽疫病羊组织中提取PPRVRNA，进行基因免疫的相关研究，结果表明：参考Genbank发表的小反刍兽疫的H、F序列，应用VectorNTI软

3、件，设计五段引物，通过PCR方法分别扩增两段包含H抗原位点的片段和三段包含F抗原位点的片段，酶切后插入原核表达载体PET-28b中，经PCR、酶切和测序鉴定为阳性质粒后转化E．coilRosetta并用SDS．PAGE和Western．BloWing观察其表达情况，结果显示H蛋白的两段抗原位点以及F蛋白的三段主要抗原位点均得到了高效表达。将表达产物经纯化后作为抗原包被ELISA板可以检测到动物体内的病毒血清抗体；参考Genbank发表的小反刍兽疫的序列，针对小反刍兽疫N、H、F三个蛋白基因应用VectorNTI软件分别设计一对引物，用P

4、CR方法从病羊组织中分别扩增N、H、F的ORF序列，酶切后插入真核表达载体plRESlneo中。经PCR、酶切和测序鉴定为阳性质粒后转染Vero细胞，24h后用荧光显微镜观察其体外表达的情况，结果显示能在体外表达：提取四种真核表达阳性质粒：plRESl-N、plRESl．H、plRESl．F和plRESl-NF和空质粒plRESmeo(阴性对照)进行动物免疫实验。选择十二只山羊，分成六组(在免疫之前分别从每只羊采集血液两毫升)两只为一组。每隔两周免疫一次，共免疫五次。每次每只羊免疫1．5ml(质粒浓度为20n∥u1)，在每次免疫之前静脉

5、采血。免疫结束后用Westem．Bloamg和ELSIA检测方法检测血清中的抗体，除了对照质粒(没有任何病毒蛋白基因)之外，每种质粒均能产生抗体。关键词：N和H基因；小反刍兽疫；基因免疫StudiesongeneimmunizationofPestedespetitsruminantsAbstractPestedespefitsruminantsisaacuteorsubacute，higmycontagiousdieaseofdomesticandwildsmallrumianats，especiallysheepandgoats．I

6、tiscausedbyPestedespetitsruminantsvirus(PPRV)thatisalsoknownasfever,oeulo-nasaldiseharges，stomatitispneumoenteritiscomplex．PestedespetitsruminantsvirusisparamyxovirusclassifiedintheMorbillivirusgenusalong晰mrinderpestvirus(RPV)，phocinedistemper(PDV)measlesvkus(MV)anddolph

7、inmorbillivirus(CDV)forallthesevirllsesarecloselyrelated．Ithassixcomponentsproteins：N／H／F／M／L／P．HandFgeneareveryimportanttoinduceresponseofprotectionhostimmuneagainstthevirusandmostofthenetutralisingantibodiesareproductdirectlyagainstHgene．HoweverNisthemostabundantandthe

8、mostimmunogenicproteinofPPRVproteins，doesnotinduceprotectiveimmunityagainsttheyirus．Ithasbeenusedinthed