扁桃酸的立体选择性代谢和手性转化机制研究

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1、浙江人学硕上学位论文摘要扁桃酸的立体选择性代谢和手性转化机制研究浙江大学药学院：2007级硕士研究生：导师：药物分析学高凌波曾苏教授摘要扁桃酸(mandelicacid，MA)，又名苦杏仁酸和a．羟基苯乙酸，是尿路杀菌剂扁桃酸乌洛托品、末稍血管扩张剂环扁桃酸、滴眼药羟苄唑及阿托品类解痉剂的重要中间体，同时也是苯乙烯的尿中主要代谢物。最早关于MA代谢的研究显示MA在人和狗的体内可部分脱氢生成苯乙酮酸(PGA)。1990年Drummond等研究发现MA在大鼠体内至少有2种代谢途径：S-MA手性转化为R．MA和进一步代谢生成PGA。首次发现MA在体内除代谢为PGA外，还

2、会发生手性转化。本实验室的研究发现，MA在SD大鼠体内发生了很强的立体选择性代谢。MA在哺乳类动物中的立体选择性代谢和手性转化机理至今尚不清楚，人体中MA是否也会发生立体选择性代谢和手性转化，也有待研究。本实验通过分子克隆、化学合成等技术和多种体外代谢模型研究扁桃酸的立体选择性代谢和手性转化过程，探讨MA立体选择性代谢和手性转化过程的内在机制，具有极其重要的意义。目的克隆、表达人和大鼠醇脱氢酶(ADH)、醛．酮还原酶(AKR)全长cDNA，研究扁桃酸(MA)的立体选择性代谢和手性转化机制，同时采用分子对接的方法分析配体MA对映体与人ADH2配体结合区的相互作用，另

3、外还采用各种体外代谢模型研究MA代谢酶存在的部位、辅酶依赖性等性质。化学合成S．MA．CoA硫酯，考察其在大鼠肝匀浆中水解的构型转化情况，探讨MA的手性转化机制。方法1)设计引物，利用RT．PCR克隆人和SD大鼠醇脱氢酶、醛．酮还原酶基因全长cDNA。测序正确的cDNA被克隆到表达载体pET．28a(+)上并在大肠杆菌BL21(DE3)中稳定表达。利用亲和色谱纯化相应的酶，通过检测其在340nm吸光度值的变化进行酶活性测定。获得的醇脱氢酶与MA对映体，醛．酮还原酶与PGAIII浙江大学硕lj学位论文摘要共孵育，采用HPLC分析其代谢和转化情况。同时将MA与人ADH

4、2配体结合腔进行分子对接，从能量和结合模式上分析MA对映体与蛋白的结合情况。另外还考察扁桃酸结构类似物邻氯扁桃酸和苯乙二醇在人和大鼠醇脱氢酶中的代谢。2)采用CaCl2沉淀法制备人、大鼠、小鼠肝和肺微粒体，同时制备大鼠肝s9、微粒体、线粒体、胞浆蛋白，分别与20P．g·mL。1MA单个对映体于37。C孵育2h，HPLC检测体外立体选择性代谢情况，同时分别添加NADPH、NADP、NADH、NAD四种辅因子，考察它们对MA代谢的影响；此外，采用苹果酸脱氢酶抑制剂草酰乙酸、5．单磷酸腺苷进行体外抑制实验，并购买商品化的猪心苹果酸脱氢酶来探讨MA的代谢是否由该酶介导。3

5、)化学合成S-MA．CoA硫酯，UPLC．MS／MS鉴定，采用半制备柱进行色谱纯化，纯化后冷冻干燥，与SD大鼠肝匀浆共孵育，用普通HPLC和柱前手性衍生化色谱分析产物及产物的构型情况。结果1’)通过测序，目的蛋白的eDNA序列完全正确，在宿主菌中获得良好的可溶性表达，经Ni2+亲和柱纯化后目的蛋白达到了电泳纯，具有较好的催化活性。人ADH2对扁桃酸的代谢具有立体选择性，优先代谢S-MA，对S-MA的代谢能力较强。大鼠ADHl对扁桃酸无代谢，人和大鼠AKR对苯乙酮酸均无代谢。邻氯扁桃酸和苯乙二醇在人和大鼠醇脱氢酶中均无代谢。对接结果显示，人ADH2蛋白上的3个氨基酸

6、残基与S-MA形成5个氢键作用，而仅2个氨基酸残基与R．MA形成2个氢键作用，从能量和结合模式上分析，S-MA与蛋白结合更加稳定，因此其优先代谢S-MA。2)MA两个对映体在大鼠、小鼠和人肝、肺微粒体中保持稳定，未检测到PGA；S-MA在SD大鼠肝S9、胞浆、线粒体蛋白中被代谢生成PGA，而R．MA在各组分蛋白中无代谢。线粒体和胞浆蛋白代谢MA生成PGA量相当。加入各种辅因子后，MA的代谢未见增强。5．单磷酸腺苷和草酰乙酸抑制S-MA在SD大鼠胞浆蛋白和线粒体蛋白中的代谢，并且抑制效应随着抑制剂浓度的不断升高而增强。当草酰乙酸浓度增加至10mmol·L‘1时，酶活

7、性完全被抑制，S-MA不被代谢；当5．单磷酸腺苷浓度达到7．5mmol·L-1时，约80％的酶活性被抑制。MA对映体在猪心苹果酸脱氢酶中均未发生变化，添加任一辅因子也都未有PGA生成。3)合成的黄色固体结晶经MS初步检测显示有m／z900([MA．CoA．H]。)的分子离子峰，二级质谱对m／z100—950范围的离子进行全扫描显示m／z900母离子的子lV浙江大学硕：匕学位论文摘要离子峰除m／z766(【CoA．H]．)峰外，其他的子离子和CoA的子离子碎片峰完全一致，主要有m／z686、408、338、159、134等，表明合成的化合物为目标化合物，并成功纯化。

8、非手性HP