hiv1中和表位肽和抗病毒蓝藻蛋白n的表达及其生物活性的初步的研究

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1、H1V-I中和表位肽和抗病毒蓝藻蛋白-N的表达及其生物活性的初步研究摘要艾滋病病毒进入CD4+T淋巴细胞首先是通过病毒与细胞膜的融合来完成的，该过程涉及到病毒表面包膜糖蛋白(gpl20和gp41)与细胞表面受体蛋白(CD4和CCR5等)之间的相互作用。根据对这些蛋白质结构和作用机理的认识，本文从阻断病毒与宿主细胞的融合入手，设计新型的抗艾滋病药物及疫苗。研究工作主要包括：第一部分抗病毒蓝藻蛋白-N的克隆表达及其生物活性的初步研究；第二部分针对gp41多表位一表位中和肽的克隆表达及其抗体的制备。第一部分抗病毒蓝藻蛋白-N的表达及其生物活性的初步研究。Cyanovirin-

2、N(CV-N)是美国科学家Boyd等于1997年在椭孢念珠藻(Nostocelliposporum)中发现的一种大小为11KD的天然抗病毒多肽。研究表明，CV-N对HIV，SIV，Ebola等多种包膜病毒具有显著的抑制作用。CV-N能与病毒包膜糖蛋白特异性结合，从而阻断病毒与宿主细胞的融合，抑制阻断病毒的感染，CV-N的这一功能使之有希望成为一种广谱的抗病毒药物。根据本实验室已构建的pMD．CVN为模板，设计引物，利用PCR技术扩增出CV-N基因，将成熟CV-N的编码框序列构建到原核表达载体pET-His中，在氨苄青霉素平板上筛选抗性转化子，并经PCR、双酶切鉴定，挑选

3、出阳性克隆子进行扩增，DNA测序正确，表明成功地构建了原核表达重组载体pET-CVN。将重组载体pET-CVN转化宿主菌BL21(DE3)，异丙基．13．D．半乳糖(IPTG)诱导表达目的蛋白。SDS—PAGE分析鉴定目的蛋白，分析发现与预期外源目的基因表达产物相当的12．7KD左右处有特异蛋白条带，且目的蛋白是以包涵体的形式表达，凝胶成像仪分析其表达量高达42．O％。采用透析法重折叠进行复性，亲和层析分离纯化此带有组氨酸标签重组的CVoN融合蛋白。用亲和层析分离纯化后的CV-N融合蛋白作为抗原，与弗氏佐剂完全乳化，采用皮下多点注射免疫的方法免疫昆明种小鼠，经过31天的

4、免疫，获得鼠抗CV-N的多克隆抗体。采用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法，测得抗体效价超过1：8000，蛋白印迹(Westernblot)分析结果显示，该抗体能特异性地与CV-N抗原产生明显免疫亲和反应。通过ELISA及免疫印迹实验证实，重组CV-N与gpl20有很强的亲和能力：在体外重组CV-N对流感病毒的抑制实验表明，重组CV-N能抑制流感病毒生长繁HIV-I中和表位肽和抗病毒蓝藻蛋白．N的表达及其生物活性的初步研究殖；采用直接标记法对重组CV-N进行异硫氰酸荧光素(FITC)的标记：FITC标记的重组CV-N能与淋巴细胞相互作用，并且与不同种类的淋巴细胞的亲和能

5、力不同，提示淋巴细胞表面有CV-N的靶蛋白。本研究采用pET原核表达系统克隆表达CV-N，制备了鼠抗CV-N多克隆抗体，用FITC标记重组CV-N，初步探索重组CV-N的抗病毒生物活性。建立原核高效稳定表达CV-N系统，获得具有生物学活性的CV-N蛋白，所制备的抗体具有很强的灵敏性和特异性，为进一步研究开发CV-N作为抗病毒的生物药品奠定了基础。第二部分针对gp41多表位．表位中和肽的克隆表达及其抗体的制备。自从20世纪80年代中期AIDS已发展成为一种全球性的流行病以来，尽管人们对预防和治疗AIDS疫苗的研究进行了不懈努力，但至今还没有一种疫苗能获得理想的效果。最新研

6、究进展表明，人源单克隆中和抗体研究取得注目的突破性进展，为中和抗体机制的艾滋病疫苗发展提供了合理基础。在前人对HIV-1中和表位肽研究分析的基础上，设计引物，利用PCR技术扩增得到目的表位肽段2F54E10(NEQELLELDKWASLWN-NWFDIT)的核苷酸序列，利用基因工程技术进行串联表达。经多步克隆，将目的基因多中和表位．表位2F54E10进行自连，获得目的基因的四串联体，并将四串联体克隆到原核表达质粒pET-His中，在氨苄青霉素平板上筛选抗性转化子，并经PCR、双酶切鉴定，挑选出阳性克隆进行扩增，DNA测序正确，表明成功地构建了原核表达重组质粒pET-(2

7、F54E10)4。重组质粒pET-(2F54E10)4转入Goldcode表达宿主菌中，IPTG诱导表达，SDS—PAGE鉴定目的蛋白，凝胶电泳分析发现在预期外源目的基因表达产物的理论Mr值12．OKD左右处有特异蛋白条带，而质粒pET-His诱导表达后无此特异的蛋白条带，且目的蛋白是以包涵体的形式表达，采用切胶回收纯化法分离纯化目的蛋白，用分离纯化后的2F54E10融合蛋白作为抗原，与弗氏佐剂完全乳化，采用腹腔注射免疫的方法免疫小鼠，经过4l天的免疫，获得制备鼠抗2F54E10的多克隆抗体，采用ELISA检测抗体的效价为1：12800，