猪2型圆环病毒全基因组测序分析和感染克隆的研究

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1、SequenceAnalysisofPorcineCircovirusType2CompleteGenomeandInfectiousCloneResearchThesissubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomySunWeibo（CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine）Supervisor:AssociateProf.QinXiaobingProf.ShanH

2、uQingdao.ChinaJune,2015万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制

3、手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要猪2型圆环病毒全基因组的测序分析和感染克隆研究摘要猪2型圆环病毒（Porcinecircovirus2,PCV2），是至今为止发现的最小的动物病毒之一。其主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征，对规模化养殖场造成了不可估量的损失。由于其可引起免疫器官的病理变化，使猪自身的免疫系统受损，更加剧了其他病原菌的侵入，加重病情。现在越来越受到养殖者和科研工作

4、者的关注。本试验从山东省收集了多份PMWS疑似病料，并根据PCV2的Cap蛋白通过Prime5设计了一对特异性引物，用来检测。将阳性病料再经过磷钨酸染色，在透射电镜下观察。莱西的病料中观察到了17nm左右的PCV2病毒粒子。并将病料接种到PK-15细胞中，用D-氨基葡萄糖处理，增加病毒的感染量。连续盲传6代，并用PCR来检测每代收获的病毒液。经检测，全为阳性。为接下来的试验提供了试验材料。根据GenBank中己发表的PCV2全基因序列，设计一对特异性引物，用PCR方法直接从接毒细胞中扩增出PCV2的全基因组序列。将扩增片段克隆于pMD19-T载体进行测序，结果表

5、明PCV2基因组全长为1767bp。应用DNAstar分析结果表明，在1479bp-1468bp处都含有特殊的TCA/AAC/CCC/CG(T)C序列，所以基因型为PCV2-1型。同时与选取的国内外23株已公布的序列进行系统进化树比较，确定其基因亚型为PCV2-1B，并命名为LX株。再选取山东地区的6株序列进行分析，核苷酸序列的同源性均超过96.9%，同源性较高，其3个ORF均出现了突变。ORF1和ORF3没有引起氨基酸的变化，而ORF2有2处氨基酸发生突变，128R-W，179S-F，而128位位于PCV2独特的抗原位点，推测影响PCV2的抗原性，进而影响毒力

6、。将pMD19-T-PCV2用SacⅡ单酶切，回收PCV2全基因。同时将目的载体pBLuescriptKS载体用SacⅡ单酶切回收，并用去磷酸化酶CIAP处理，防止载体自连。将PCV2-1B与pBluescriptKS连接，获得了两个重组克隆载体，分别命名为pBluescriptKS-PCV2（+）和pBluescriptKS-PCV2（-）。将2个载体转染PK-15细胞，通过RT-PCR检测，结果表明构建的PCV2克隆具有感染性，但是pBluescriptKS-PCV2（+）的感染性较强。本研究成功克隆出PCV2的全基因，并构建了两个感染性克隆，为PCV2的致

7、病机理和新型疫苗的研制提供了技术和理论依据。关键字：PCV2；全基因序列；同源性；感染性克隆万方数据青岛农业大学硕士学位论文AbstractSequenceAnalysisofPorcineCircovirusType2CompleteGenomeandInfectiousCloneResearchAbstractPorcinecircovirustype2(Porcinecircovirus2,PCV2),wasoneofthesmallestanimalvirusfoundsofar.PCV2wasthemaincauseofpostweaningmulti

8、systemicwast