美洲商陆抗病毒蛋白在细胞内转运途径的研究

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1、Au‘hor，55，gnature:卫泣企班呀户SuPervisor，5signatureThesisreviewerl:ThesisreviewerZ:mediealSehoolThesiSfCVieWCt3:Chair:MediealSehoolCo们nrnitteemanl:Co们n们以itteemanZ:DateoforaldefeflCe:Jlllles2008J2008浙江大学硕士学位论文致谢本论文是在导师詹金彪教授的悉心指导和支持下完成的!这两年来，导师在学业上给予的谆谆教诲，在实验方面给予的悉心指导，在生活上关怀····一直以来的宽容，理解和鼓励，

2、我满怀感激!导师严谨的治学态度，广博的学识，对科学研究孜孜不倦的追求，是我尊敬的，学习的榜样。感谢生化教研室全体老师和同学的关心和支持!感谢浙大医学院细胞生物所李继承老师教授，生理教研室Bruce教授在论文写作上给予的指导和建议。感谢杨萍老师在电镜实验上的帮助。感谢本实验室的刘波，邹媛，黄建松，刘洋，杨乃娣，余晓乐，张黎黎等师兄师姐师弟师妹在实验和生活上的支持、关心和帮助。还有万晓晨，沈培，刘黎明，王志勇，寝室的姐妹们，因为你们大家，我的研究生生活充满了美好的回忆!最后，感谢我的亲人和朋友们，你们无私关怀和爱护一直是我努力坚持的动力!真诚的感谢，祝福!2008浙江

3、大学硕士学位论文美洲商陆抗病毒蛋白在细胞内转运途径研究浙江大学医学院生物化学与分子生物学专业2006级硕士研究生李芳琼导师詹金彪中文摘要美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweedantiviralprotein，PAP)是一种存在于美洲商陆护勺勿lacc。Americana)叶子中的I型核糖体失活蛋白，有多种生物学功能。与n型核糖体失活蛋白不同，它具有良好的抗肿瘤和抗病毒活性，特别是它能抑制HIV-1的复制，可能有临床应用前景，因而受到了广泛关注。本论文在实验室已有基础上成功将P妙基因克隆至表达载体pET一44a(+)并在大肠杆菌中表达，利用非放射性EUSA方法，证实了

4、PAP对HIV-1整合酶有抑制作用，ICS。为1.82林创ml。此外，结构上PAp只具有一条活性A链，目前为止国内外对不含受体链B链的I型核糖体失活蛋白包括PAP，在哺乳细胞内细胞内的转运途径研究很少，利用免疫电镜胶体金实验，我们发现PAp在HEP一GZ细胞内转运到达了内质网和细胞核.PAP能够入核表明它很可能通过进入细胞核内发挥切割病毒基因组或抑制Hlv-1整合酶，从而达到抑制病毒复制的目的.1.PAp墓因的表达，纯化及活性鉴定利用本实验室构建的pET一44a(+)一P妙原核表达基因，将质粒pET一44a(+)一pAP用CaC12法转化进入丑coliBLZI(D

5、E3)中，经lmMIPTG诱导表达得kljpAP包涵体.包涵体经过尿素变性，低温透析复性后，用颇料亲和层析(Blue一s即harose)和弱阳离子交换层析(CM-s即harose)法纯化.纯化蛋白浓缩后用Brandford法测定蛋白浓度，12%SDS一PAGE检测蛋白纯度，密度扫描蛋白的纯度达到95%.以MTT法验证以P对肝癌细胞HEP一G2和肿瘤细胞的细胞毒性并计算ICS。，PAP对HeLa和HEP一GZ细胞的Ics。分别为22林创而和17林创血1.将不同浓度的PAp与质粒pBluescriPtsK(+)超螺旋DNA反应，PAp能将超螺旋DNA切割成线性和开环2

6、008浙江大学硕士学位论文DNA.结果表明:以包涵体形式表达的重组PAP经过变性与复性，纯化恢复了良好的生物学活性.2.PAP多克隆杭体制备健康新西兰雄兔2只，初次免疫每只兔子用1mgpAp与完全弗氏佐剂1:1混合乳化后皮下多点注射。以后每隔一周加强免疫一次，加强免疫每只兔子用0.5mgRAp与不完全弗氏佐剂1:1混合乳化皮下多点注射.第3次加强免疫后一周颈动脉采血，分离血清。在初次免疫前于每只兔子的耳缘静脉各取2ml血液，分离血清于一20℃冻存，作为阴性对照.EUSA法测定抗体效价达到1:128000。WestemBlot检测抗体特异性，未纯化和已纯化的PAP以

7、及HEP一GZ细胞破碎液在12%SDS一PAGE胶上电泳，湿转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭后，一抗(兔抗PAP多克隆抗体1:5000稀释)孵育，过氧化物酶标记羊抗兔二抗孵育，ECL显影检测。未纯化和纯化的蛋白样品处均只有PAP被抗体识别出来，说明PAp抗血清有良好的特异性.此外，HEP一GZ细胞破碎液的泳道未见条带，说明PAp抗血清对HEP一GZ细胞的蛋白没有非特异的识别，为下一步进行免疫电镜试验打下基础。3.PAp对EJ琴1整合酶的抑制实验HIV-1整合酶是在细胞核内将病毒。DNA整合进入人体基因组的关键酶.为检测PAP对整合酶是否具有抑制作用，我们采用一种

8、非放射性E