猪巨细胞病毒gb基因的原核表达与重组蛋白间接elisa方法的建立

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扬州大学硕士学位论文2个表达载体(分别命名为pGEX—gBl和pGEX-gB2)，测序结果表明与在GenBank已收录的序列同源性分别为99．4％和100％。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导，由SDS-PAGE电泳分析证实gBl和gB2基因获得了表达，蛋白分子量分别约为39KDa和36KDa，分别命名为GST-gBl和GST-gB2。其中重组蛋白GST-gBl以包涵体的形式存在，GST-gB2以可溶性蛋白形式存在。经Western．blot分析证实表达的重组蛋白抗原性良好。GST-gBl用切胶纯化法，GST-gB2通过GSH—Sefinose柱纯化。以纯化的重组蛋白GST-gB2作为诊断抗原建立间接ELISA检测方法。运用方阵试验法确定最适抗原包被浓度为2gg／nm，血清的最佳稀释度为1：100，阳性临界值为0．224，阴性临界值为O．189，建立的ELISA方法的灵敏度为1：3200。关键词：PCMVgB基因；同源性；原核表达；间接ELISA 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立3ProkaryoticexpressionofgBgeneofPorcineCytomegalovirusandDevelopmentofindirectELISA●●l●‘0IrecomblnantproteinM．D．Candidate：FengxiangZhaoSupervisor：Prof．JianshengXuAbstractPorcinecytomegalovirusinfection(PCMVI)isanoppommisticinfectionineasyinfectedherds，itcancauseclinicalsymptomasfetusandyoungswinedied，rhinitis，pneumonicfeverandretardedgrowthandSOon．Itsinfectedanimallimitedinswine．PCMVwasfirstdiscoveredisolatedbyDoneinUKinl955．Thediseaseisepidemicinallovertheworld，thediseaseincidenceisespeciallyhi曲inUK，AmericaandJapan．Ininfectedherds，morethan90％ofswinesareseropositive．Itindicatedthatthediseaseinfectionisubiquitouswitllherds．AccordingtothegBgeneofPCMVfromGenBank，twopairsofprimersweredesignedbyselectingconservedistrictinPCMVgBsequence，theoneisdetectedprimer,theotheristotallengthofPCMVgBgene．Usingdetectedprimertodetectnasalswabspecimens丘Iom‰gzllou，Huaian，YanchengandHaianthroughPCR．Theresultsshowedthat23of53clinicalsampleswerepositive谢tllapositiverateof43．4％．Usingtotallengthprimeramplifiedtotalsequence，itslengthWaS2627bp．ThegenesequenceWasclonedintopUCm—Tvector．Thesequencingresultshowedthatthenucleotidehomologywas97．8％-99．4％andaminoacidhomologyWas97．1％一99．3％comparedwiththePCMVgBfromGenBank．ThecladogramwasanalyzedbyDNAStars，The 扬州大学硕士学位论文4resultshowedthatthesampleofthisstudywasinthesamecluster、析thUKstrain．GermanystrainandHunanstraininourcountry．ThebiologycharacteristicsandsignalpeptideofPCMVgBantigenproteinwereanalyzedbybioinformaticssoftwareandDNAStars．TheimmunityreactivityofPCMVgBantigenproteinwaspredictedbythisstudy．Accordingtothe妒geneofPCMVfromGenBank，twopairsofprimersweredesignedbychoosingimmunodominantregionofPCMVgBgenes(namedPCMVgBlandPCMVgB2)．ThegenesequenceofgBlandgB2wasamplifiedbyPCR．TwogenesequencesandexpressionvectorpGEX一6p-1weredigestedbyBamHIandSalI，AndthentheywererecombinatedintoprokaryoticexpressionvectorpGEX··6p-·l(namedpGEX—gBlandpGEX—gB2)．Thesequencingresultsshowedthatthenucleofidehomologieswere99．4％and100％comparedwitllthePCMVgBfromGenBank．TherecombinantplasmidsweretransformedintoE．coliBL21(DE3)andinducedbyIPTGTheresultofSDS-PAGEanalysisshowedthatgBantigengenewassuccessfullyexpressedinE．coliBL21(DES)．Themolecularweightswere39KDaand36KDa(namedGST-gBIandGST-gB2)．TherecombinationproteinGST-gBlWasexpressedwi吐ltheformofinclusionbody,GST-gB2Wasexpressedwiththeformofsolubility．TheimmunityreactivityoftherecombinantproteinswasconfirmedbyWestem—blot．TherecombinantproteinGST-gBlwaspurifiedbycuttinggel，GST-gB2waspurifiedbyGSH—Sefinose，TherecombinantproteinGST-gB2wasusedasdetectedantigentoestablishtheindirectELISAmethod．ThecoatingconcentrationofrecombinateproteinandseradilutestrengthofPCMVinfectedswinewere21xg／mLand1：100，thepositivecriticalvaluewas0．224，thenegativecriticalvalueWasO．189，thesensitivityofdetectinganti-PCMVserawasI：3200．Keywords：PCMVgBgene；homology；prokaryoticexpression；indirectELISA 扬州大学硕士学位论文PCMVgBMCP删此mLPCRELISAPFT-FDNAdNTPSDS符号说明PorcinecytomegalovirusGlycoproteinBMajorCapsidProteinPorcineAlveolarMacrophageMicmliterMilliliter猪巨细胞病毒糖蛋白B主要衣壳蛋白猪肺泡巨噬细胞微升毫升Polymerasechainreaction聚合酶链式反应Enzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验Porcinefallopiantubefibroblast输卵管成纤维细胞Deoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸Deoxy-ribonucleosidetriphosphateSodiumdodecylsulfate三磷酸脱氧核(糖核)苷十二烷基硫酸钠SDS-PAGESDS．polyacrylamidegeleletrophoresis聚丙烯酰氨凝胶电泳ODDTTmlnKDaAmpPBS印mTris．ClIPTGEcoliOpticaldensityDithiothreitolMinuteKilodaltonAmpicillinPhosphatebuffersodiumRotationperminuteTrishydrochlorideIsopropyl-p—D—thiogalactosedeEsherichiacoli光密度二硫苏糖醇分钟干道尔顿6氨苄青霉素磷酸盐缓冲液转每分钟三(羟)甲基氨基甲烷盐酸盐异丙基硫代．p．D．半乳糖苷大肠杆菌 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立综述猪巨细胞病毒的研究进展猪巨细胞病毒(porcinecytomegalovirus，PCMV)感染是能够在易感猪群中引起的一种以胎儿和仔猪死亡、发育迟缓、鼻炎、肺炎及生长发育不良、增重差等临床症状为特征的常见传染病【1】。此外，该病毒还能引起神经系统症状。Done于1955年首次于英格兰分离到本病毒。他发现在患有鼻炎的猪鼻甲骨黏膜上的粘液腺肿大上皮细胞中存有一种大型嗜碱性核内包涵体，因此称之为包涵体鼻炎病毒(inclusion．bodyrhinitisvirus)，是继伪狂犬病病毒之后发现的第二个猪的疱疹病毒【21。在电镜下观察，发现本病毒的性质及其所致病变与人的巨细胞病毒和豚鼠的唾液腺病毒非常类似，又因包涵体鼻炎的简称为IBR，与牛传染性鼻气管炎(infectiousbovinerhinotracheitis)的简称相同13】，因此为防止混淆，该病毒又称猪巨细胞病毒(PCMV)或猪细胞巨化病毒。PCMV主要感染动物是猪，普遍存在于猪群中。近年来，在使用猪的活体细胞、组织和器官来进行人器官移植的研究中对PCMV的关注越来越深入，本病毒常诱发潜伏性感染，类似于人类和灵长类动物的巨细胞病毒(CMVs)【4'5】。曾有报道，在猪与灵长类动物之间的异种移植时，PCMV可进行交叉种间传播【61，但是PCMV对人类受体感染的危险性仍未确定。1病原学PCMV(猪疱疹病毒2型)属于疱疹病毒科，p疱疹病毒亚科、巨细胞病毒属成员⋯01，是具有囊膜的线性双链DNA病毒，还有研究表明PCMV也可以被归类为p疱疹病毒的玫瑰疹病毒属111】。其基因组分子量大小为(130．150)x106。目前其全长基因组序列和病毒基因组的结构仍不清楚，近年来，对聚合酶、糖蛋白B(gB)和主要的核衣壳蛋白(MCP)基因的研究表明，PCMV的遗传性比人巨细胞病毒更接近于人疱疹病毒6型和7型【11,12J。PCMV在形态上是一种典型的疱疹病毒。病毒颗粒中央为电子致密的形状呈卵圆形或长方形的核芯，其直径为30．70nln。在芯髓外围为衣壳蛋白构成的核衣壳， 扬少I'1大学硕士学位论文呈正二十面体状，其直径约80．120nnl，在宿主细胞核中的病毒核衣壳有一个电子致密外壳，该外壳以一个半透明带与囊膜分离。最外层为囊膜，多为单层，偶尔也有双层，带囊膜的完整病毒粒子直径为150．200Illil。囊膜上还有纤突。虽然不同地区的PCMV分离株的聚合酶和gB基因的遗传学不同，但是其血清型还未区分[11,13】。抗原变异的可能性已经有报道【14】。本病毒对氯仿和乙醚敏感，在56℃经30rain可灭活；22℃下只能保持24h；保存在．30℃下，患病仔猪鼻黏膜的感染力至少持续5个月；在一60℃下的病毒悬液，可保存二年以上【15】。2病毒的培养Ecuyer和Comer(1966)将一株猪巨细胞病毒在猪肺原代细胞上传了几代[16】。Watt[1。7】(1973)等发现猪巨细胞病毒只在猪肺泡巨噬细胞(PAM)上能良好地增殖，尤其以3．5周龄原代的仔猪肺泡巨噬细胞最适宜于病毒的首次分离和连续传代，而且由于肺泡巨噬细胞经常受到包括PRRSV在内的病毒污染，故在细胞使用之前要对其进行监测，确保安全可靠、无污染。最好的办法是使用无菌猪或SPF猪肺泡巨噬细胞。但据Bouillant【18】等(1975)报道，猪的输卵管细胞可使包括PCMV在内的多种动物病毒增殖，其他的培养系统包括猪原代睾丸(ST)细胞(Shirai【19，201等，1985：Kanitz和Woodrufff2¨，1976)、PK一15细胞系(Kanitz和Thacker[221，1974)和鼻甲骨(PT)(Yoon等【23】，1996)。猪肾、睾丸和鼻甲骨被感染后，直接作带毒培养，病毒可充分增殖，并出现细胞病变，但在它们未感染病毒的原代细胞中不能培养。应用Bouillant等建立的输卵管类上皮和输卵管类成纤维细胞(PFT-F)培养PCMV，结果表明，两种细胞对病毒均敏感，但后者更敏感。因PCMV的细胞病变难以观察，所以须用姬姆萨染色，观察核内包涵体[241。PCMV接种细胞后3．14d，被感染的细胞中可看到巨细胞形成嗜碱性细胞核内包涵体，偶尔在细胞浆内看到小的嗜酸性包涵体旧。感染病毒后的细胞体积极度增大，约为正常细胞的6倍，线粒体、内质网、和高尔基体也出现膨胀。病毒复制的最高滴度在接种PCMV后10．14d出现，可达10铀TCID50／mL，在原代细胞中复制 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立9病毒的产量比在细胞系中复制的产量高[15,]61。3流行病学PCMv可以通过口鼻水平传播【25功】。一般认为，一月龄左右的猪是经鼻感染的，感染常出现在围产期或产后f28．291，可能主要是通过与母猪接触而导致感染。病毒由鼻汁、尿、眼分泌物、子宫颈部粘液口6'30。321等排出，飞沫和吮乳可能是直接的传播途径，在猪间呈水平传播。1日龄无菌仔猪在感染病毒后，鼻腔排毒可达1个月，而老龄猪在同样条件下排毒时间大约是9d。由于从睾丸中分离到了本病毒，所以交配也可发生感染，但精液中是否存在本病毒还未证实。感染后的康复猪终生呈隐性感染长期带毒，取一般饲养的5-6月龄猪的PAM进行培养，几乎可100％地分离出PCMV。处于潜伏感染状态的猪可因寒冷、运输、分娩等应激作用而再次激活从而排毒【331。另外，本病毒也可垂直感染【1,15】。PCMV分布相当广泛，从近年的报道看，凡饲养猪只的地区几乎都有本病流行p41。欧洲很多国家发现了本病，PCMV抗体阳性率都很高，但大多数为亚临床型，临床发病则很少见。其中英国发病率较高，猪群的抗体阳性率为90％12l】；德国用PCR方法检测，调查结果发现PCMV流行率要高于50％t35】；北美和澳大利亚也有报道，据统计，美国血清抗体阳性率达到90％；川村齐(1991)报道，日本自1972年以后才有本病病理学方面的报道【27。，1985年首次分离到病毒，1981年6．11月，对441例肉猪血清用间接荧光抗体法(IFA)做了抗体调查，有98．4％(434／441)为阳性，用ELISA所作的调查，99．4％(433／436)为强阳性【36】，并于1985年首次分离到病毒；台湾于1987年曾报道过本病的发生，致死率为13．43％(47／350)【3】；我国学者于2008年于湖南浏阳和江西景德镇不同养殖场进行PCR检测，60．78％(31／51)137]ff-,jBEI性，血清学检测结果阳性率达到95．21％(657／690)。由以上统计结果说明凡饲养猪只的地区，都可能有本病毒的感染【弼J。4临床症状PCMV同其它巨细胞病毒一样，常呈现隐性感染，尤其是3周龄以上的猪PCMV 扬州大学硕士学位论文lO感染通常不表现临床症状，需要一定的外因条件，才能引起发病，促使发病的外因条件，主要是鼻黏膜的继发性细菌感染，如波氏杆菌和嗜血杆菌等。病毒感染的潜伏期是10．20d[391。妊娠母猪感染后在整个妊娠期未见有发热或其他临床异常，但在病毒血症阶段常常会嗜眠、食欲不振。但首次感染发生于妊娠后期的母猪，产出仔猪木乃伊胎和死胎的数量增加，有的会导致不育等繁殖障碍【2325,40】。仔猪的死亡率也增加了，仔猪的死亡率达N25％。耐过的仔猪表现为贫血、皮肤或黏膜苍白、生长及发育不良、呈现不同程度的水肿，尤其是颌和跗关节水肿较为明显。1．3周龄仔猪对本病毒最为敏感，可能为致死性的，发病程度取决于从初乳中获得母源性抗体的多少。急性型主要发生在产后5．10日龄仔猪上，病猪的最初症状为频繁的打喷嚏，咳嗽，眼角流泪，鼻孔流出浆液性分泌物【34,41-44]，继而因鼻腔堵塞导致吮乳困难，食欲不振，精神沉郁，体重下降较快，如果无母源性抗体的仔猪感染，则可能发生鼻衄，严重的可见颤抖和呼吸困难，并出现麻痹症状。可在发病后5天死亡，死亡率最高达20％。耐过的仔猪表现发育障碍或鼻甲骨发生萎缩引起脸部变形，据野外长期观察表明，可能是因为PCMV和支气管败血波氏杆菌之间的协同作用所致【34，411，但在实验条件下未发现协同作用【31】。2周龄以上的仔猪如果无并发或继发其他感染，主要呈亚急性经过，仅表现为轻度的呼吸道感染症状，发病率和死亡率都很低，绝大多数病猪经3．4周恢复正常。但有些初次感染的成年猪与妊娠母猪相似，在病毒血症阶段会出现嗜H民、食欲不振，并产生全身性感染的损害。4周龄以上猪感染没有明显的临床症状表现。康复后的猪常为隐性感染，能够长期排毒，这些猪只都是危险的传染源。尽管未发现PCMV与其他病原的并发感染和可能的协同作用，然而有研究表明，感染PCMv的猪比未感染PCMV的猪更容易患呼吸性疾病【45】。5病理变化5．1肉眼病变幼龄猪出现全身感染时，全身的皮下组织显著水肿晰】。剖检后，可见胸腔有 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立11清澈透明的积水，凝固后呈黄色胶冻状；心包液也增加至30一50mL；肺脏全面性水肿，尤其是肺小叶间中隔充满着清澈的液体，极度扩张，肺浆膜面变厚，前叶及中叶有小区域的暗红色肝变区；有的仔猪鼻黏膜显著潮红，表面附有少量浆液性或粘液性排出物，深部黏膜常有细胞聚集而成的灰白色小病灶；全身淋巴结点出血或有轻度水肿；肝脏表面及切面有少数散发灰白色小点。其余脏器无明显的肉眼变化【3J。3d"月龄以上的猪，几乎无肉眼可见的变化。5．2组织学病变病猪剖检后，采适当大小的病变脏器制成切片，用苏木精及伊红染色，置于电镜下观察。结果在鼻中隔黏膜发现极具特征性的病变。黏膜扁平化，纤毛脱落，黏膜有淤血，有多处的小坏死灶及少量淋巴球的浸润，部分管状泡状腺上皮细胞有不同程度的的肿胀，严重者肿胀达5．10倍，在肿大的上皮细胞内含有特大的不定形嗜碱性核内包涵体，核内包涵体最初充满于核内，后期则集中于核的中心，与核膜间形成透明带。电镜观察形成核内包涵体的细胞，可见核内有未成熟的仅有衣壳的病毒粒子，细胞质的空泡内有带囊膜的成熟病毒粒子。另外在鼻黏膜上皮细胞中也可见不等量的纺锤形细胞增生。其他上皮细胞，特别是泪腺的管状泡状腺、哈德氏腺及尿细小管上皮细胞内也有许多巨大的嗜碱性核内包涵体形成。但在食道的粘液腺、十二指肠及空肠黏膜、睾丸上皮管、输精管的上皮细胞中也可见少量的嗜碱性包涵体。肺脏病变也颇具特征性，肺小叶间中隔内含多量粉红色纤维蛋白性渗出物，极度扩张，肝变区的肺泡壁内细胞显著增生充塞于肺泡腔内则。肝脏有轻度脂肪变性，并有多量的纺锤形细胞增生，肝脏及肾上腺的皮质部有局部性的淋巴球浸润。淋巴结可见轻度水肿，淋巴滤泡有多量嗜酸性球浸润，周围的淋巴球显著减少，肾的病变为间质性肾炎一71。此外，在中枢神经系统，有多处的小神经胶细胞增殖和血管套形成，有时在神经胶质细胞内也可见核内包涵体[48】。6免疫人工实验感染PCMV时，以未吮乳的仔猪最为易感，潜伏期约5．10天。感染途 扬州大学硕士学位论文12径以静脉或经鼻接种为宜。健康仔猪感染2．3周后，通过间接免疫荧光抗体(IFA)试验可检测到抗体，感染后大约第6周达到高峰，并至少持续lO．11周【25,32]。通过IFA可以发现，试验猪体内血清抗体水平的增高与病毒血症的消失几乎同时发生，但鼻腔排毒仍持续2．3周。排泄物中病毒的长期存在可能是由于体内抗体水平较低【491。在商业性猪场发现了一个类似的抗体反应模式，抗体持续至wJ23周龄屠宰时为止，中和抗体增长缓慢，抗体水平很低。Edington等证明带有低水平抗体的母猪的重复感染与胎盘感染有关，从而表明了高水平的抗体具有免疫保护性【4们。先天性和新生仔猪病毒感染不产生抗体，但是仍然排毒，发生致命的全身性感染。患过本病母猪的初乳内含有中和抗体，对哺乳仔猪有一定的保护力。但是在PCMV呈地方性流行的饲养单位，似乎在循环母源抗体存在时才释放【2引，出生后母源抗体大约持续2个月[501(Taijima等，1994)。目前对此病无治疗方法，迄今也尚未见有疫苗研制的报道。但在发生鼻炎时，为预防细菌继发感染可使用抗菌类药物l”j。7实验室诊断对呈现传染性鼻炎症状的仔猪，特别是处于出生后1．4周的仔猪，要考虑到发生PCMV感染的可能性，因此阶段为患本病的最为敏感的时期。对表现出类似SMEDI综合征繁殖障碍症状的母猪，必须同猪腺病毒、细小病毒以及伪狂犬病毒感染猪做出鉴别诊断。可取病料直接做电镜检查，如果是PCMV感染，那么在感染的上皮细胞内可看到巨大的嗜碱性核内包涵体，并且本病毒感染不引起流产，由此方法可以与上述病毒感染加以区分[1,15,3引。7．1病毒分离与鉴定对怀疑感染PCMV仔猪，可以将其鼻汁，鼻腔、咽头、结膜等的拭子洗液以及肺、肾、淋巴结的组织研磨液等材料，接种于无菌或SPF猪的肺泡巨噬细胞或输卵管类成纤维细胞进行病毒分离，也可以用肺泡巨噬细胞、睾丸(ST)细胞、鼻甲骨(PT)细胞等直接培养分离病毒【20。2孔。接种病料后或直接培养7．14天，发现培养的细胞核内出现包涵体，用荧光抗体染色，在细胞质内可见强荧光染色抗原。 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立13应用已知标准毒株的免疫血清和其细胞培养物为对照，对分离毒株进行中和试验，即可达到鉴定目的。病毒的形态观察也有一定参考价值，电镜下可看到在感染的细胞核和细胞浆内(主要为空泡内)有大量呈结晶状排列或散在的疱疹病毒粒子存在。7．2血清学诊断血清抗体检测具有方便、实用、操作简单、结果可靠等特点，适合大规模猪群的抗体检测。血清抗体是确诊猪群中存在PCMV最可信的方法，用感染的肺泡巨噬细胞或输卵管类成纤维细胞(PFT_F)进行间接荧光抗体染色法检查，其敏感度比中和试验高8倍以上。感染后3周可检出抗体，6周后达最高值，现场猪的抗体效价多为64—128倍。病毒株间无血清学差异。也可应用感染的输卵管类上皮细胞作ELISA[36,sl】，它与间接荧光抗体具有相同的敏感度。现场猪在2．3周龄感染病毒，并呈终生持续感染，抗体经5．6周龄转阳。Tajima等(1994)以血纸法建立TELISA法，并将血清检法与全血法的抗体效价进行了比较，样品的吸收值高度相关(r：O．88)，对26份田间收集的血纸进行检查，发现仔猪出生后8周母源抗体水平降低，并从4头猪中检出IgM抗体‘501。传统的血清学诊断方法存在弊端，PCMV在猪肺泡巨噬细胞复制的很慢，然而输卵管类成纤维细胞的应用被证实不能够满足需要，因此，在体外培养体系中较低的滴定度和较差的重复性消弱了用在诊断试验上和ELISA实验的抗原制备量。随着分子生物学的快速发展及对PCMV糖蛋白B(gB)基因的研究的进一步深入，近年来有研究者将PCMV主要抗原基INgB基因与原核表达载体重组进行体外表达。以重组蛋白为抗原，感染PCMV猪的血清为抗体进行ELISA诊断，研究结果表明灵敏度也很高。7．3分子生物学诊断Hamel等(1999)首次报道了应用PCR方法诊断本病【35】，采用直接从具有不同临床综合征的病猪鼻黏膜和肺脏的刮削物提取DNA的方法，共检查了126份样品，其中检出59份阳性样品，阳性率达到46％，此方法有可能成为检测PCMV的常规方法。此后，Fryer等(2001)运用定量竞争PCR对不同的猪器官(包括用于异种移 扬州大学硕士学位论文14植供体)进行了PCMV的检测，可以从每微克DNAqb检出低于10至97个基因组拷贝，表BflPCR方法灵敏度非常高【52l。所以建立了简便、快速、准确和可靠的PCR诊断方法是相当有必要的。PCR检测采取样品比较方便、快捷，仅需用棉签在鼻孔内刮取少量鼻腔分泌物即可，试验敏感度较高，因此减少了很多工作量。另外鼻拭子采样法即可对死亡猪只也可对活体猪只进行，并且对活体猪的应激性较小，能满足流行病学预防、活体抗原检测等实际工作的需要。但是PCR检测方法的实验成本高，对试验操作者的技术、实验室的条件要求也高，所以不适宜疾病的大规模普查，急需更灵敏、快捷、经济的检测方法出台。8结论近年来，随着分子生物学技术的不断发展，人们对PCMV的聚合酶、糖蛋白B(gB)和主要的核衣壳蛋白(MCP)基因的研究已经有了很大的进展，其中对PCMVMCP与其他疱疹病毒的MCPs的种族遗传性和氨基酸的同源性进行了研究，结果表明PCMV是p疱疹病毒，与人疱疹病毒6型和7型的同源性非常高。同时研究证明人工感染PCMV的血清不能与细菌表达的MCP反应，表明PCM'V的MCP可能与感染后体液免疫应答无关，而糖蛋白B(gB)是疱疹病毒感染的很重要的蛋白，是一个含量很高的潜伏免疫原，这种蛋白将成为未来研究的热剧1l】。目前，随着科学技术的不断发展，猪器官对人体器官的异种移植逐渐在医学上被认可，但是在异种移植上有很多因素影响其进展，包括免疫学的、生理学的、解剖学的和伦理道德等问题。一则近来的试验表明，在从猪到鼠的器官移植中有病源的传播，这一报道是阻碍器官异种移植的一个实例。还有一则报道中将PCMV描述成是异种器官移植的动物性传染源。在这则试验报道中，虽然PCMV没有感染一些人源的细胞培养物，但是，这个结果没有确定排除PCMV在体内对人细胞感染的可能性。因此，目前急需建立快速检测PCⅢ感染的方法，近几年有人用PCR方法来对PCMV感染有机器官做检测，但是PCR检测方法的实验成本高，对试验操作者的技术、实验室的条件要求也高，因此急需更简便快捷的检测方法的出台。ELISA具有灵敏性高、特异性强的优点，适用于开展大规模的血清流行病学研究。在疱 赵锋祥猪巨细胞病毒班基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立15疹病毒与宿主的相互作用中，病毒的囊膜糖蛋白(gB蛋白)起着重要作用，在识别宿主细胞、病毒吸附细胞、病毒粒子释放和侵入宿主细胞、病毒粒子的毒力以及稳定性等方面起到非常重要的作用，它还是宿主免疫系统识别的主要抗原。因此邸蛋白是建立ELISA检测PCMV感染方法的理想包被抗原，借助合适的表达载体系统制备足够的抗原即可进行检测。同时，gB蛋白有望成为制各新型亚单位疫苗和基因工程的候选蛋白。 扬州大学硕士学位论文16研究一猪巨细胞病毒gB基因的克隆及生物学特性分析摘要：根据GenBank收录的猪巨细胞病毒(PCMV)gB基因序列设计了两对引物，一对检测引物，一对全长基因引物，对来自江苏扬州、淮安、盐城和海安等地的病死仔猪的鼻拭子样品(53份)进行PCR检测，结果约43．4％(23／53)检测为阳性，用全长引物扩增出PCMVgB基因全长序列，经测序后与GenBank的PCMVgB基因进行同源性比较，结果同源性在97．8％．99．4％之间，编码的氨基酸序列同源性在97．1％．99．3％之间，并应用DNAStar软件和相关生物信息学网站对gB基因编码的氨基酸生物学特性进行了分析，预测gB基因编码的氨基酸抗原性良好。关键词：PCMVgB；PCR检测；同源性；生物学特性1材料1．1菌株及病料宿主菌E．coliDH5a由扬州大学兽医学院微生物教研室保存；PCMV病料由扬州大学动物医院送检病猪中采得。1．2工具酶与试剂限制性内切酶BamHI、SaII、EcoRI，标准分子量DNAMarkerDLl2000、DL2000，10×dNTPs，TaqDNA聚合酶等均购自大连宝生物生物公司；pUCm-T载体购自Promega公司；T4DNA连接酶、lO×ligasebuffer购自Fermentas公司；DNA凝胶纯化试剂盒购自BBI公司；5-溴一4-氯．3．吲哚．D半乳糖苷(X．gal)、异丙基硫代-p—D-半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(Ampicillin)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购白Sigma公司；标准分子量蛋白购自Fermentas公司；蛋白酶K购自于德国MERCK公司；其它试剂为国产分析纯级。1．3培养基LB培养基：1％NaCl，1％胰蛋白胨，0．5％酵母提取物，如果为固体培养基加入1．5．1．7％的琼脂粉。 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立17Amp+LB培养基：向LB液体或固体培养基中加入氨苄青霉素使终浓度为50gg／mL。Amp+X．gal+IPTG+LB／平板：在制备好的Amp+LB平板上加20p．LX—gal(20mg／mL)和10gLIPTG(200mg／mL)，用灭菌L型玻璃棒均匀涂布于平板表面，37℃温育正面朝上1．2h至完全吸收。2方法2．1病料采集2009-2010年在江苏省扬州大学动物医院采集送检的死亡或濒临死亡的仔猪，仔猪的年龄为1~2月龄，采集方法主要是鼻拭子采集和肺脏采集，具体方法如下：(1)鼻拭子采集：用经高压灭菌过的医用棉签，尽量伸到仔猪的鼻孔深出，轻轻地旋转数周，取出拭子放入事先准备好的盛有1mLPBS(含抗生素)的灭菌离心管中，每头猪采集两个鼻拭子，标记好时间和来源地，标记完立刻送往实验室检测；(2)肺脏采集：左手持无菌镊子固定肺脏，右手持无菌手术剪剪下小块肺脏盛于无菌的塑料袋中，每头猪的肺脏和鼻拭子相对应标记好，标记好立刻送往实验室检测，如果不能立即检测，就暂存于．20℃冰箱，长期保存应放于．70℃冰箱。2．2病料的检测2．2．1模板的制备鼻拭子：将鼻拭子在离心管壁上尽量挤压充分，然后取出拭子；放入离心机6000～8000rpm离心15rain去除杂质；取上清到另一离心管，13000rpm离心10min，去上清：加340uLPBS悬浮，加入40gL10％SDS，20p．L蛋白酶K(10mg／pL)，37℃水浴30min；水浴完加入等体积的酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)抽提，12000rpm离心5min；取上清再抽提一次，12000rpm离心5min；取上清加入1／10体积的3MNaAc，再加入2．5倍体积的无水乙醇，置于．20℃至少2h或液氮气相15rnin；4℃13000rpm离心15min，小心吸去上清：用70％7,醇悬浮沉淀，12000rpm离心3min，去上清，真空抽干或37℃干燥；加入20～30“L的超纯水溶解沉淀，PCR 扬州大学硕士学位论文检测或存于．20℃备用⋯。肺脏：无菌剪下豆粒大小的肺脏，先用无菌的PBS充分清洗，然后先用无菌剪刀把小块肺脏先尽量剪碎，再在研钵中研磨，尽量研磨充分，研磨充分后用3mL的PBS悬浮，转入3支离心管中，每管约1mL，下面模板的提取步骤与上述取出鼻拭子后的操作步骤相同。2．2．2引物的设计与合成PCR引物的设计根据GenBank收录的PCMVgB基因序列(登录号为AF268039，AF268040，AF268041，AF394056，AF394057，FJ595497，FJ844360，FJ870561，FJ870562，FJ870563，FJ870564)的同源性比较结果分析，选择突变率较低的区域利用Primer5软件设计两对引物，一对为检测引物，另一对为扩增全长序列引物，分别命名为PCMVgBI和PCMVgB(见表1·1)表1-1本研究中所用的引物序列Tablel-1thePCRprimersusedinthisstudy2．2．3PCR检测以2．2．1提取的基因组为模板，以PCMVFgBl、PCMVRgBl为引物进行扩增．PCR扩增体系为：模板DNA1“LPCMVFgBl、PCMVRgBI(25mmol／L)各0．5“L10xPCRBuffer2．5“L 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基冈的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立19dNTP(2．5mmol／L)2gLrTaq(5U／I_tL)O．5此加ddH2018止总体系25“L反应程序：95℃预变性4min，94℃变性0．5min，72。C退火0．5min，72℃延伸0．5min，30个循环，72℃终延伸7min，取6gLPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。2．3gBl基因的克隆与鉴定2．3．1gBl基因扩增产物的回收与纯化用胶回收试剂盒回收电泳后的PCR产物，按试剂盒说明进行操作。具体操作如下：取50¨L上述PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下切取目的片段条带，装入1．5mL离心管中，称取重量；向胶块中加入3倍体积的BindingBuffer，55℃水浴10min(每2min振荡一次)使胶完全溶化，移入吸附柱中，10000rpm室温离心1mira倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中，向吸附柱中加入500gLWashingBuffer洗柱，10000rpm离心1min，倾去收集管中的液体，重复此步骤操作一次；将吸附柱放回收集管中，10000rpm离心30s，尽量除去漂洗液；将吸附柱开盖置于室温2min，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步实验；然后将吸附柱放入干净的1．5mL离心管中，在吸附膜中央滴入30．40“LElutionBuffer，置于50．60℃水浴2mira10000rpm室温离心1min，收集管的液体贮存于．20℃备用(此步可以重复一次，以提高回收效率)。2．3．2纯化的目的基因gBl与T载体连接将已纯化的扩增片段PCMVgBl与载体pUCm-T进行连接。反应体系如下：10xligasebuffer1“LpUCm—TVector1¨LT4DNALigase0．5肛LPCR回收产物5LLLddH202．5pL 扬州大学硕士学位论文20反应总体系10肛L，轻轻混匀后，于16℃或4℃连接过夜。2．3．3DH5a感受态细胞的制备以《分子克隆实验指南》(第三版)采用氯化钙法进行【53】。首先复苏宿主菌，在无菌条件下从冻存管中挑取一环菌种DH5a在新鲜的LB平板上进行四区划线，放于37℃培养箱中过夜培养16．20h；在无菌条件下从LB平板上挑取单个菌落(直径约2．3mm)，接种到含5mL新鲜LB液体培养基的试管中，37℃振摇培养过夜；在无菌条件下取50“L培养物，转接到含5mLLB液体培养基的试管中，37℃剧烈振摇培养约2．3h，每隔5．10min测量OD600值以观察细菌培养物的生长情况(以OD600=0．3．O．5为宜，此时细菌生长到对数生长中期，制备的感受态细胞转化效率较高)：在无菌条件下，将细菌培养物分装转入灭菌的用冰预冷的1．5mL的离一tl,管中，冰浴10min，使培养物冷却至O℃；4℃，4000rpm离心5min，收取细菌沉淀，尽可能除去培养液；用500gL冰预冷的O．1mol／LCaCl2(过滤除菌)重悬细菌沉淀，冰上放置30mirl；4℃，4000rpm离心5min，尽可能弃净上清；加160gL用冰预冷的0．1mol／LCaCl2重新悬起细菌沉淀；加40pL甘油至终浓度20％，．70℃保存备用。2．3．4连接产物转化感受态细胞取10pL上述连接产物加入200gL感受态细胞DH5a中，轻轻混匀后冰浴30min；42℃热休克90s后，迅速冰浴2mira加入800gL无抗性LB培养液(培养液提前在37℃预热)，37℃摇床培养1h(60rpm)；8000rpm离心3min，用移液器小心吸取800此上清弃去，剩余约200gL菌液，充分混匀后均匀涂布于Amp+X．gal+IPTG+的LB琼脂平板上，置于37℃培养箱内培养12．16h。2．3．5重组质粒pUCm．T-gBl的提取随机挑取数个生长于LB平板上的白色单菌落，分别接种于含有5mLAmp+的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜；取培养菌液1．5mL于离心管中，4℃，12000rpm离心5mini弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，尽可能的除去残留的培养液；加入溶液I(4℃保存)100gL，在振荡器上充分振荡均匀；加入的溶液II(现配现用)200gL，轻柔的颠倒离心管5-6次，使菌体充分裂解，可见裂解后 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立21的茵体变得清亮，随后将离心管放置冰上2．3min(尽量不要超过3min)；加入溶液111150gL，立即快速颠倒离心管5．6次至出现白色沉淀，置于冰上5min后，4℃，12000rpm离心5min；吸取上清液约450gL转入另一新的离心管中(注意不要吸到白色沉淀)，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)溶液，充分振荡混匀，4℃12000rpm离心5min，将上层液相转移至另一新的离心管内(注意不要吸到下层)；加入2倍体积的无水乙醇，放置．20℃沉淀20min，4℃，12000rpm离心5rain，吸弃上清，用吸水纸除去管壁上的液滴；用lmL冰预冷70％乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心2min，吸弃上清，除尽管壁上液体，放于37℃烘箱晾干沉淀(大约10min)；加入30p．L含RNaseA(20gg／mL)的TE(pH8．O)溶解沉淀物，．20℃冻存备用。2．3．6重组质粒pUCm-T-gBl的酶切鉴定将阳性重组质粒pUCm-T-gBl分别经BamHI和SalI双酶切鉴定，并以1％琼脂糖凝胶电泳分析结果。以DNA分子量MarkerDL2000做为参照，判断片段大小。BamHI和EcoRI双酶切鉴定体系如下：质粒pUCm—T-gBlBamHIEcoRI10xHBuffer10xKBufferddH204“L0．5gL0．5gL1gL1gL3gL总体系10“L，混匀后于37℃水浴反应4h，取10¨L进行1％琼脂糖凝胶电泳。以DNA分子量Marker为对照，初步分析酶切结果正确后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。2．4PCMVgB基因的扩增将检测到的阳性样品用引物PCMVFgB、PCMVRgB扩增，PCR扩增体系为：模板DNA1此PCMVFgB、PCMVRgB(25mmol／L)各0．5“L 扬州大学硕士学位论文10xPCRBuffer2．5“LdNTP(2．5mmol／L)2“Lrraq(5U／卜tL)0．5“LddH2018LlL总体系25¨L，反应程序：94℃预变性5min，94℃变性0．5min，55℃退火O．5min，72℃延伸2．5min，35个循环，72℃终延伸7min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。2．4．1gB基因PCR扩增产物的回收与纯化用胶回收试剂盒回收电泳后的PCR产物，按试剂盒说明进行操作。具体操作如2．3．1操作。2．4．2纯化的目的基因妒片段与T载体连接将已纯化的gB基因扩增片段与载体pUCm．T进行连接。反应体系如下：10xligasebufferlULpUCm-TVector1此1"4DNALigase0．5“LgB基因PCR回收产物5“LddH202．5“L反应总体系10“L，轻轻混匀后，于16℃或4℃连接过夜。2．4．3DH5a感受态细胞的制备感受态细胞的制备方法如2．3．3操作。2．4．4连接产物转化感受态细胞方法如2．3．4操作。2．4．5重组质粒pUCm-T-gB的提取质粒提取方法如2．3．5操作。2．4．6重组质粒pUCm-T-gB及质粒的单双酶切鉴定将阳性重组质粒pUCm．T-gB分别经BamHI单酶切，BamHI和SalI双酶切 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立鉴定，BamHI单酶切鉴定体系如下：质粒pUCm—T-gBBamHI10xButYerKddH20总体系10pL，轻轻混匀。BamHI和EcoRI双酶切鉴定体系如下：4“L0．5“L1¨L4．5pL质粒pUCm—T-gB4此BamHIO．5“LEcoRIO．5“L10xHBuffer1斗L。lOxKBufferl“LddH203“L总体系10¨L，轻轻混匀后和上述单酶切体系同时放于37℃水浴反应4h，各取10¨L进行l％琼脂糖凝胶电泳。以DNA标准分子量MarkerDL2000和MarkerDLl2000做为参照，判断片段大小。初步分析酶切结果及质粒大小正确后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。2．5PCMVgB抗原蛋白的生物学特性分析利用生物信息学软件和网络平台为工具进行分析PCMVgB抗原蛋白的生物学特性。应用Protfun程序中的子程序SignalP预测PCMVgB抗原基因编码蛋白信号肽及其剪切位点的位置(信号肽的作用是在蛋白质分泌时引导其越过内质网穿过细胞膜，蛋白质越过膜之后信号肽即被剪断)154】；应用DNAStar软件的子程序Protean，预测氨基酸的亲水性和抗原性[55巧7】。所用分析软件的网址见表1．2。表1-2相关生物学分析软件的网址1陆ble1-2Internetsiteofbiologyanalysissoftware项目网站Protparamhttp．／／au．expasy．org／tools／protparam．htmL 扬州人学硕士学位论文3结果243．1gBl基因的PCR扩增如图1-1所示为PCR扩增的PCMVgBl基因的电泳图。电泳结果显示，待检样品PCR产物在凝胶中出现了明显的条带，与DNAMarker比较可知其大小为356bp左右，这与预期扩增的目的片段大小相吻合，初步确定扩增的片段为目的基因PCMVgBI。图l·1gB,基因片段电泳图Fig．1—1Agar0SegelelectrophoresisofPCRproductsofgBlgeneM：DNA分子量标准DL2000；2811：gB,基因PCR产物M：DL2000DNAMarker；1：PCRproductsofgBlgene3．2重组质粒pUCm-T-gBl的鉴定将提取的重组质粒pUCm·TogBI样品进行BamHI和EcoRI双酶切鉴定，得到长约356bp和2773bp的两条带，证明该质粒为阳性重组质粒(图1．2)bpM12000lOoo500250图1．2重组质粒pUCm．T-gBl双酶切鉴定Fig．1-2IdentificationofrecombinantplasmidspUCm-T-981byenzymedigestionM：DNA分子量标准DL2000；l：重组质粒pUCm-T-gBl经BamHI和EcoRI双酶切产物M：DL2000DNAMarker；l：pUCm-T-gBldigestedgBlproductsbyBamHIandEcoRI咖∞如∞枷嗍姗渤m 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立25如图1-3所示为PCR扩增的PCMVgB基因的电泳图。电泳结果显示，待检样品PCR产物在凝胶中出现了明显的条带，与DNAMarker比较可知其大小为2627bp左右，这与预期扩增的目的片段大小相吻合，初步确定扩增的片段为目的基因PCMVgB。bpM16000300020001500图1-3gB基因片段电泳图。Fig．1-3AgarosegelelectrophoresisofPCRe—productsofgageneM：DNA分子量标准DLl2000；】：gB基因PCR产物M：DL12000DNAMarker；l：PCRproductsofgBgene3．4重组质粒pUCm—TogB的鉴定将提取的重组质粒pUCm—T-gB进行单、双酶切鉴定。未经酶切的环状质粒长约3600bp，经BamHI单酶切可得到长约5400bp的一条带，经BamHI和EcoRI双酶双酶切得到长约2627bp和2773bp的两条带(因长度相差很小所以两条带重合在一起)，分别与预期条带大小相吻合，证明该质粒即为阳性重组质粒(图1．4)。bpM12312000600050003000图1．4重组质粒pUCm—T-98及酶切鉴定 扬州大学硕士学位论文Fig．1-4IdentificationofrecombinantplasmidspUCm·I"-gBbyenzymedigestionM：DNA分子量标准DLl2000；1：重组质粒pUCm．T-98；2：BamHI和EcoRI双酶切产物：3：BamHI单酶切产物M：DLl2000DNAMarker；1：recombinantplasmids；2：DigestedproductsbyBamHIand髓DRI；3：DigestedproductsbyBamHI3．5重组质粒pUCm—T-gB的序列分析3．5．1PCMVgB基因序列及其编码的氨基酸序列的同源性分析经测序结果表明，连到pUCm．T载体上的的PCMVgB基因大小为2627bp，其中完整的gB基因大小为2580bp，含有完整的开放阅读框，编码860个氨基酸残基。将所获得PCMVgB基因序列与GenBank中已收录的AF268039，AF268040，AF268041，AF394056，AF394057，FJ595497，FJ844360，FJ870564进行比较，核苷酸序列同源性高达97．8％～99．4％(见图1．5)。与同群的英国株和湖南株(见3．5．2进化树分析)相比较，只有在294bp(C—T)，996bp(T—C)，2190bp(C—T)，2238bp(A----C)，2277bp(C—T)五处有突变，其编码的氨基酸序列的同源性高达97．1％～99．3％(见图1．6)，说明本实验得到PCMVgB基因的保守性较好。∞U亡∞口lL-∞：}oPercentIden撕12345678譬1■_97．998．298。2100．0钧．9鲐．098．幸99．1121．5_99．099．297．897每99．O97．797．8231．6o．7_99598．297J999．297．998_341．6O．60．5l98297．g99．797．998．145O．O1．51．61．6‘_98．998，O98．599一S61．11．g1，91．91．0_97．798．699．毒671国O盛O．80．31名2．1_97797．978O．91．7O．90．71一_989890．81，71．70．8O．61．90．5。_娶12345678gAF筋8039．UKseqAF2铺040．Spa．seq_^F268雅1．Jap．seqAF394056．Sw．seqAF3辨0研．Ger．seqFJ59鞋97．HN．S鲢FJ844360．NB．seqFJ870564．FJ．seqPCMVgB．jS．seq图1-5PCMVgB基因的同源性分析(本实验的序列如图下划线所示)Fig．1-5HomologyanalysisofPCMVgBgene(ThesampleofthisexperimentisshoⅥmastheunderlined) 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立∞UC∞口L-m．≥凸Percenl|den哲ty123毒56781l98．597．1991％．797．2∞．9121．犀l97o99，3％．596．597．098．5232_52．6。_97698．498．毒99，297．1340七O奄2．0‘■97197—97-699-1452．93'11．52．5■98．099．196．7562毒2．6122．O1．5_98．6∞，767242怎O．72．OO名0,9I97278O．o1．42．50．8282_42．毒_8123毒5678PCMVgB-Ger．proPCMVgB-HN．DfOPCMVgB-Jap．酎OPCMVgB-JS．甜OPCMVgB-NB．proPCMVgS-Spa．proPCMVgB-Sw．D『oPCI涕49B-UKpro图1-6PCMVgB基因编码氨基酸的同源性分析(本实验的序列如图下划线所示)Fig。1-6HomologyanalysisofPCMVgBgenesencodedaminoacids(Thesampleofthisexperimentisshownastheunderlined)3．5．2PCMVgB基因序列进化树分析运用DNAStars子程序MegAlign对所获得PCMVgB基因序列与GenBank中已收录的AF268039，AF268040，AF268041，AF394056，AF394057，FJ595497，FJ844360，FJ870564进行进化树分析，结果显示目前流行的猪巨细胞病毒主要分为两个群，本实验将其命名为I群和II群(图1—7)，I群包括湖南株、福建株、英国株和德国株；II群包括宁波株、瑞典株、日本株和西班牙株，本实验检测的PCMV属于该病毒流行的I群，猜测可能是由于江苏，湖南和福建猪的品系是从英国或者德国引进而来，而宁波的猪的品系能是从瑞典引进而来的原因。NudeotiOeflubstitutions∞∞}O 扬州大学硕士学位论文图l-7PCMVgB基因序列进化树分析Fig．1-7TheevolutionarytreeanalysisofPCMVgBgene(ThisexperimemsampleisshownaStheunderlined)3．6PCMVgB基因编码蛋白的生物学性分析3．6．1PCMVgB基因编码的氨基酸信号肽的分析通过运用Protfun软件中SignalP3．0Server-prediction分析蛋白质信号肽和引导肽的预测结果见图1．8，对于一个典型的信号肽，C和Y分值在剪切位点下游的第一个残基(如下图中的第24个氨基酸残基N)点会较高，而S分值在剪切位点之前会高，在剪切位点之后会低，由此可知PCMVgB基因编码蛋白的N端1．23个氨基酸残基为其信号肽部分，信号肽截断点最大可能在23．24个氨基酸残基处。图1-8信号肽的位置Fig．1-8signalpeptideandleaderpeptidelocation3．6．2PCMVgB基因编码的抗原表位分析应用Kyte—Doolittle方法预测蛋白的亲水性，由图可知，亲水性较强的主要在以下区段的氨基酸残基，Asn64一Ilell3、Glul78一Gly207、Asn269一Pr0306、Glu321一G1y412，Glu430-Leu450，Ala476一Leu491，Ser528·Ar9552，Asn561一Lys594，Ser676．Val689、Asn778一Cys818、Leu826．Val859。结果见图1-9，抗原区大部分都 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基冈的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立29在亲水区。2}黪75镯滋嫩氆毖岱嚣掇鞠32}嚣绕糍稻翰搦巍必黝搦隧眨戳啜礴滋瑚援辫滋渤图1-9Kyte—Doolittle方法预测PCMVgB抗原蛋白的亲水性Fig．1-9HydrophilicityofPCMVgBantigenproteinpredictedbyKyte·Doolittlemethod应用Jameson—Wolf方案预测PCMVgB抗原蛋白的B细胞表位，B细胞表位主要集中在以下区段的氨基酸残基，Ser23一Ala57、Asn64Cys83、Asnl01一Leull5、Thrl30一Asnl68，Glul78一Leu201，Trp228一Ala334，Thr371-Val406，Ar9422-Ala453，Trp477一Lys511，Val525·Pr0553，Ser560一Lys594，Iie630一Leu693、Thr751-Thr758、Asn769．Met819、Asn825．Glu850，见图1．10。广1_]—丁1—r．T—T__T—T_1—T__r—广T]—T]—下1—r1—T__T—广_r—广T1—下_1—r1—可蒌嚣瑟辫荔镭弼鞠Z黝蕊戮戮瑚职谨谨嘲辑臻滋獭皲翳繇辫瞬臻硒i嚣霹磁纪强l勤臻幽i地名纽乌黝垣搦五；庇厘励Ⅱ磁j：：觑渤h蕴心覆，。ll彪庞j旷譬譬。f譬。¨rgl’1i_i早1gIf，I’f憎鞫。Wi¨11lVfF静僧i酽l冒黝铆7Vr謦‘f图l一10Jameson．Wolf方案预测PCMVgB抗原蛋白的B细胞表位Fig．1-10BcellepitopeofPCMVgBantigenproteinpredictedbyJameson-Wolfmethod4讨论近年来，Fredefik等分析表明，PCMVgB基因由完整的ORF推导出的蛋白质序列有长度为860或861个氨基酸，经系统进化树分析表明，PCMVgB基因与D疱疹病毒的相对应的gB基因有着最紧密的关系，尤其是人疱疹病毒6型(HHV-6)和7型(HHV-7)的同源性分别达到43．5％和42．0％，与人巨细胞病毒(HCMV)的同源性达到35．1％【111。虽然不同地区的PCMV分离株的聚合酶和gB基因的遗传学不同，但PCMV、HCMV、HHV-6和HHV-7都同属于p疱疹病毒亚科成员。Tajima报道不同 扬州大学硕士学位论文来源的PCMV血清型中可能存在有抗原的变异【141，但是截至目前，还没有关于PCMV进化成不同的血清型的报道1u,13】。本实验对来自江苏扬州、淮安、盐城和海安等地的仔猪的鼻拭子样品(53份)进行PCR检测，结果约43．4％(23／53)检测为阳性，用PCMVgB全长引物扩增出全长为2627bp基因序列，本试验中的PCMVgB基因经测序后与其它国家和国内部分地区的PCMv毒株的gB基因的序列进行了比对分析，结果显示，其核苷酸序列同源性为97．8％,-,99．4％，与同群的英国株和湖南株相比较，只有在294bp(C—T)，996bp(T—C)，2190bp(C—T)，2238bp(A—C)，2277bp(C—T)五处有突变，氨基酸序列同源性为97．1％---99．3％，表明本实验中的PCMVgB基因高度保守，没有出现明显的变异。PCMVgB基因进化树分析把这些毒株分为两个基因群，本实验中的检测的PCMV与英国株、德国株为一个群，其中还包括中国湖南株和福建株，命名为I群；瑞典株、日本株、西班牙株及中国宁波株为另一个群，命名为II群。这说明了我国PCMV流行株与国外流行株类似，也是两个群内的PCMV，我国的PCMV流行可能受国外引进猪种的影响，导致本实验中的PCMV与宁波株而不在同一个群，通过本实验的研究结果也可以为我国的PCMV流行情况提供有价值的参考。本实验应用DNAStars软件和相关生物信息学工具对gB基因编码的氨基酸生物学特性进行了分析，预测出PCMVgB基因所编码的氨基酸在第9．24个氨基酸残基处可能是信号肽，剪切位点在23和24个氨基酸残基处，在C末端部分706．726和730．747个残基处有两个预测的跨膜片段，信号肽与跨膜片段均为疏水性，成熟蛋白中不包括信号肽序列，而跨膜片段是稀有密码子密集区域，推测这些因素将不利于gB糖蛋白的表达，在25．690和750．850氨基酸残基处抗原表位优势明显，预测结果表明gB基因编码的氨基酸的抗原性良好。 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立31，研究二PCMVgB基因抗原富集区基因gBl与gB2的原核表达及重组蛋白的抗原性分析摘要：根据GerLBank中已经发表的PCMVgB基因序列，在选择抗原富集区的两段基因设计两对引物(分别命名为PCMVgBl和PCMVgB2)，PCR扩增并回收gBl，gB2基因，将两PCR产物与原核表达载体pGEX一6p．1分别双酶切，连接并转化入大肠杆菌BL21(DE3)中，测序结果表明与在NCBI已发表序列同源性分别达99．4％和100％。重组菌经IPTG诱导，由SDS—PAGE电泳分析证实gBl和gB2基因获得了表达，重组蛋白分子量分别约为39KDa和36KDa，分别命名为GST-gBI和GST-gB2。其中重组蛋白GST-gBl以包涵体的形式存在，GST-gB2以可溶性蛋白形式存在。以抗PCMV血清为一抗，经Westen-blot分析证实表达的两段融合蛋白抗原性良好。关键词：GST-gB2；GST-gB2；原核表达；IPTG诱导1材料1．1菌株和质粒宿主菌E．coliDH5a、E．coliBL21(DE3)和表达质粒pGEX．6p．1由扬州大学兽医学院微生物教研室保存。1．2工具酶与试剂限制性内切酶BamHI、SalI，标准分子量DNAMarkerDLl2000、DL2000，10×dNTPs，rTaqDNA聚合酶等均购自大连宝生物生物公司：pUCm—T载体购自Promega公司；T4DNA连接酶，lOxligasebuffer购自Fermentas公司；DNA凝胶纯化试剂盒购自BBI公司；5-溴-4-氯一3一吲哚-D半乳糖苷(X．gal)、异丙基硫代一p-D-半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素(Ampicillin)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；标准分子量蛋白购自Fermentas公司；其它试剂为国产分析纯级。1．3培养基LB培养基：1％NaCl，1％胰蛋白胨，0．5％酵母提取物，如果为固体培养基加 扬州大学硕士学位论文32入1．5．1．7％的琼脂粉。Amp+LB培养基：向LB液体或固体培养基中加入氨苄青霉素使终浓度为50pg／n1L。Ampex—gal+IPTG+LB／平板：在制备好的Amp+LB平板上加20pLX．gal(20mg／mL)和10gLIPTG(200mg／mL)，用灭菌L型玻璃棒均匀涂布于平板表面，37℃温育正面朝上1．2h至完全吸收。2方法2．1引物的设计与合成根据研究一中预测结果，选择PCMVgB基因编码的氨基酸抗原性较好的区域，设计两对引物，如表2—1所示，分别引入BamHI、SalI限制性核酸内切酶酶切位点，用于gBl与gB2基因的扩增，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。表2-1本实验所用引物序列Table2-1Primersusedinthisstudy2．2目的基因的扩增按照研究一中2．2．1方法得到的产物为模板，分别以表2。1所设计的序列为引物，按以下反应体系进行PCR。模板DNAluLPrimerF(25mmol／L)0．5¨LPrimerR(25mmol／L)0．5uL 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基冈的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立3310xPCRBufferdNTP(2．5mmol／L)rTaq(5U／肛L)ddH20总体系2．5“L2“L0．5“L18“L25ULgBlPCR循环参数的选择如下：95"Cx4min一[94。Cx30s-÷55℃×30s一72"(2×30s]x30cycles--,72*(2×7min_4℃gB2PCR循环参数的选择如下：95℃x4min---}[94"(2x30s_56℃x30s--,72。Cx30s]×30cycles--．72。C×7min--,4。C分别取两者PCR产物各8皿用l％琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA标准分子量DL2000Marker为参照观察判断所扩增片段的大小。2．3目的基因gBl，gB2的酶切及纯化2．3．1目的基因gBl，gB2的酶切将目的基因gBl，gB2分别经BamHI和SalI双酶切鉴定，并以l％脂糖凝胶电泳分析结果。以DNA分子量MarkerDL2000做为参照，判断片段大小。BamHI和SalI双酶切鉴定体系如下：PCR产物gBl或gB230“LBamHI2止SalI2此IO×HBuffer5pL10xKBuffer5“LddH206“L总体系50pL，混匀后于37℃水浴反应4h，各取50“L进行1％琼脂糖凝胶电泳。将目的片段用手术刀切下来，分别放于1．5mL离心管中。2．3．2目的基因gBl，gB2酶切产物的回收与纯化用小量胶回收试剂盒回收电泳后的PCR产物，按试剂盒说明进行操作。具体 扬州大学硕士学位论文操作如研究一中2．3．1操作，将纯化后的目的片段贮存于．20℃备用。2．4重组质粒pGEX-gBl，pGEX·gB2的构建2．4．1载体质粒的处理提取载体质粒pGEX-6p-1，并做BamHI和SalI双酶切处理，酶切体系如下：pGEX·6p-l30ULBamHI2pLSalI2¨L10xHBuffer5此10xKBuffer5“LddH206pL总体系50pL，混匀后置于37℃水浴中4h，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，用小量胶回收试剂盒回收酶切后的产物，将纯化的载体质粒．20℃保存备用。2．4．2目的基因与pGEX-6p-1的连接将2．3．2中纯化的目的基因没切产物与2．4．1中酶切纯化的载体质粒pGEX-6p-1按摩尔比约3：1的比例加入连接体系(总体系20uL)，连接体系如下：10xligasebuffer2gLpGEX·6p·15“LI"4DNALigasel肚L目的片段gBl或gB25pLddHeO7lxL混匀后16℃或4℃连接过夜。2．4．3BL21(DE3)感受态细胞的制备感受态细胞的制备方法如研究一中2．3．3操作。’2．4．4连接产物的转化取连接产物20uL加入新鲜制备的大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，涂布于Amp+的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立352．4．5阳性重组子pGEX一6p-l—gBl和pGEX⋯6p1gB2的筛选随机挑取数个白色菌落，用含Ampicillin的LB液体培养基培养后，按照研究一中2．3．5方法提取质粒。2．4．6重组原核表达载体的鉴定将初选的质粒用BamHI和SalI进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下：重组质粒pGEX一6p—l—gBl或5pLpGEX一6p-1-gB2BamH10．5uLSalIO．5HL10xHBufferl¨L10×KBuffer1肛LddH202gL混匀后，于37℃水浴锅中作用4h，并以1％琼脂糖凝胶电泳分析结果，参照DLl2000和DL2000分子量标准，判断各片段的大小，在凝胶成像仪下观察结果。将鉴定为阳性的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，重组原核表达质粒分别命名为pGEX—gBl和pGEX—gB2。2．5重组质粒pGEX-gBl和pGEX-gB2的诱导表达及SDS—PAGE分析2．5．1重组质粒pGEX—gBl和pGEX—gB2在宿主菌BL21(DE3)中的诱导表达(1)用接种针在含有阳性重组质粒的菌液中挑取一环，在含氨苄青霉素(100I_tg／mL)的LB琼脂平板上划线放于37℃过夜培养；(2)次日挑取含有阳性重组质粒的单个菌落和pGEX-6p-1空载体的单菌落于5mL含氨苄青霉素(100gg／mL)的LB培养基中37℃培养过夜；(3)取过夜培养的菌液，按1：100的比例转接种于4支5mLLB液体培养基中，37℃、160rpm培养约3h，当OD600达到0．6．1．0之间时(从2．5h时开始测OD600值)，向4支试管中分别加入IPTG(100mmol／L)至终浓度分别为0rnm01]L、0．1mmol／L、O．5mmol／L、1mmol／L37℃继续摇床培养4h； 扬州大学硕士学位论文36(4)5000rpm离心10min收获菌体沉淀，每支菌液沉淀用500gLPBS重悬；(5)超声波裂解上述菌体，然后8000rpm离心10min，取出上清液，用等量的PBS悬浮沉淀；(6)分别取20pL上清与沉淀分别与5taL5×SDS凝胶加样缓冲液混匀，沸水煮沸5rain进行SDS。PAGE分析，注意做未诱导组对照，电泳结束后，取下凝胶，考马斯亮兰室温染色3h后，用甲醇．乙酸脱色液脱色过夜，中间换液一次直至背景清晰。得到的融合蛋白分别命名为GST-gBl和GST-gB2【531。(同时将含有空载体pGEX．6p一1的BL21的空白菌液在同样的条件下进行诱导)2．6重组蛋白的纯化2．6．1GST-gB2可溶性蛋白的纯化为了获得较纯的抗原，对可溶性蛋白GST-gB2进行纯化，按2．5．1摸索出的最佳条件，将过夜培养的重组菌pGEX-gB2按1：100比例接种于200mL菌液中扩大培养，具体诱导方法按2．5．1操作，超声波裂解后取上清过柱，可溶性蛋白用GSH．Sefinose纯化，具体操作过程如下：(1)平衡缓冲液配方：50mMTris．HCl缓冲液，pH8．3；配制方法：0．1MTris溶液50mL，加O．1MHCI20mL，0．9gNaCl，加水至100mL；(2)洗脱缓冲液配方：50mMTris．HCl缓冲液，pH8．31配制方法：0．1MTris溶液5mL，0．0614g还原型谷胱甘肽，然后用O．1MHCI调pH到8．3，加水至lOmL(还原型谷胱甘肽容极易氧化，最好现配现用)：(3)用10mL平衡缓冲液平衡柱子；(4)超声波裂解的上清用O．45gm的滤膜过滤后上柱，以防止堵塞柱子，取10mL过滤的上清液加入柱子，室温下使其缓慢通过层析柱，中途接收200p,L，待跑胶检测；(5)用10mL平衡缓冲液洗去未吸附的样品，中途接收200gL，待跑胶检测；(6)用5mL洗脱缓冲液，室温静止20．30min洗去吸附的样品，中途接收200gL，待跑胶检测； 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立37(7)再用10mL平衡缓冲液平衡柱子，灌满20％乙醇，以备下次使用；(8)收集的部分进行SDS．PAGE电泳分析纯化效果。2．6．2GST-gBl包涵体蛋白的纯化按2．5．1摸索出的最佳条件，将过夜培养的重组菌pGEX-gBl按l：100比例接种于200mL菌液中扩大培养，具体诱导方法按2．5．1操作，纯化方法如下：(1)超声波破碎后的的菌体8000rpm离心10min，倾倒除去上清液，沉淀悬浮于9倍体积的4℃包涵体洗涤液(pH8．0的50mmol／L"iris．C1；10mmol／LEDTA；100mmol／LNaCl；1％的TritonX．100；5mmoFLDTT)；(2)悬液放置室温5rain，4℃8000rpm离心10min，倾倒上清，沉淀用重悬于PBS中，．20℃保存备用；(3)根据目的蛋白的分子量大小配制浓缩胶和分离胶，用超大的电泳梳制成一个大的泳道上样，按常规方法电泳；(4)电泳结束后，取下凝胶，浸泡于4℃放置的O．25MKCl中进行显色，1rain内即可见乳白色的条带，根据标准分子量蛋白Marker确定目的蛋白的位置，切下条带：(5)用无菌的PBS洗涤后转入无菌研钵中充分研磨，研磨后用适量的无菌PBS重悬，放置4℃过夜，期间振摇几次，凝胶可缓慢释放蛋白；(6)12000rpm离心10min，上清即为纯化的目的蛋白，用pH7．2的PBS透析纯化的目的蛋白；(7)透析后的目的蛋白，进行常规SDS．PAGE电泳分析。2．7融合蛋白GST-gBI和GST-gB2的Western—blot分析纯化的融合蛋白GST-gBl和GST-gB2经SDS—PAGE电泳后，将凝胶上的蛋白用半干转转印至硝酸纤维素膜(NC膜)上，以抗PCMV阳性血清作为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG作为二抗进行Westem．blot分析，按《分子克隆实验指南》上的步骤进行操作【531。具体操作如下：(1)当SDS．PAGE行将结束时，剪6张3nun厚的滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC膜)，其大小与凝胶的关系是：凝胶>NC膜>滤纸： 扬州大学硕士学位论文(2)将NC膜、滤纸和凝胶在转移缓冲液中浸泡10min；依次放三层滤纸、聚丙烯酰胺凝胶、NC膜和三层滤纸，以NC膜为界，并用玻璃棒赶出气泡，确保转印装置不短路；(3)连接电源，30V，80mA电转印40min：(4)电转印结束后，取下NC膜。用去离子水冲洗两遍后，放入含5％脱脂乳的封闭液PBST中，在摇床上37℃温育2h(也可封闭过夜)；(5)弃去封闭液，用PBST洗涤NC膜三遍，每遍10rain，然后将其放入用PBST1：200稀释的一抗中，在摇床上摇动37℃温育1h；(6)回收一抗溶液，用PBST洗涤NC膜三遍，每遍10min，将NC膜移入用PBST1：5000稀释的二抗中，在摇床上37℃温育1h；(7)回收二抗溶液，用PBST洗涤NC膜三遍，每遍10min，将NC膜放入新鲜配制的显色液中显色观察Western．blot结果。3结果3．1gBl，gB2片段的PCR扩增经PCR扩增后，产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下可分别看见大约356bp和270bp的条带，如图2-1，2-2。bpM11000500250100图2．1gBl基因片段电泳图Fig．2-1AgarosegelelectrophoresisofPCRproductsofgB】geneM：DNA分子量标准DL2000；1：gBl基因PCR产物M：DL2000DNAMarker；1：PCRproductsofgB,gene 赵锋祥猪巨细胞病毒ga基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立39bpM2000500250100图2．2gB2基因片段电泳Fig．2-2AgarosegelelectrophoresisofPCRproductsofgB2geneM：DNA分子量标准DL2000：1：gs2基因PCR产物M：DL2000DNAMarker；1：PCRproductsofgB2gene3．2重组质粒pGEX—gBl和pGEX—gB2双酶切鉴定重组质粒pGEX．gBl和pGEX-gB2双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察可分别见清晰的两条带，且大小与预期吻合。表明获得了正确插入目的基因的阳性克隆，将其命名为pGEX—gBl，pGEX—gB2(如图2-3，2．4)。bpMI1M2bp2000l0007505002505000300020()o1000500图2．3重组质粒pGEX．ga．酶切图Fig．2-3Agarosegelelectrophoresisofrestrictorendonucileses-digestedofplasmidpGEX—galMl：DNA标准分子量DL2000；1：BamHl和SalI双酶切重组质粒pGEX．gBl；M2：DNA标准分子量DLI2000Ml：DNAMarkerDL2000；1：recombinantplasmidspGEX—gBldigestedbyBamHIandS口，I：M2：DNAMarkerDLl2000 扬州大学硕士学位论文bpMl1M2bp⋯．图2-4重组质粒pGEX-gB2酶切图50003000Fig·2-4Agarosegelelectrophoresisofrestrictorendonucileses。。digestedofplasmidpGEX‘’gB2M1：DNA标准分子量DL2000：1：BamHl和勋，；0．0。0．I衰酶切重组质粒pGEX．gB2；M2：DNA标准分1000子量DLl2000一‘M1：DNAMarkerDL2000；1：recombinant500‘plasmidspGEX-gB2digestedbyBamHIandSalI；M2：DNAMarkerDLl20003．3重组质粒诱导表达的SDS．PAGE分析3．3．1重组菌pGEX．gBl诱导表达的SDS．PAGE分析将重组质粒pGEX．gBl转化大肠杆菌BL21(DE3)，首先在不同温度条件下对其进行诱导表达，结果显示在各个温度都是以包涵体的形式存在，且在37℃时，表达量最高，在37℃下，用不同浓度的IPTG诱导4h后经SDS．PAGE电泳，可见在39KDa处有高蛋白表达(见图2．5)，和预期大小一致，未诱导组上清和沉淀中都未表达出目的蛋白，而当IPTG浓度为O．5mM和lmM时裂解沉淀中在39KDa有明显条带，其中在IPTG浓度为O．5mM时表达量最大，故选择在0．5mMIPTG浓度下对其诱导4h为最佳诱导条件，表达产物经超声波裂解后，融合蛋白主要存在于离心的沉淀中，提示融合蛋白表达后主要以包涵体的形式存在于菌体中。KDaM123456咖咖咖姗瑚啪，‘l屹∞如¨拍 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立41图2．5重组蛋白GST-gBl的SDS．PAGE分析Fig．2-5SDS—PAGEanalysisoftherecombinantproteinGST-gBlM：蛋白Markerl：未诱导的重组菌裂解物上清；2：未诱导的重组菌裂解物沉淀；3：0．5mMIPTG诱导的重组菌裂解物沉淀；4：0．5mMIPTG诱导的重组菌裂解物上清；5：lmMIPTG诱导的重组菌裂解物沉淀；6：lmMIPTG诱导的重组菌裂解物上清；M：ProteinMarker1：Thelysatesupematantofnon．inducedrecombinantE．coli；2：nelysatepraecipitatumofnon．inducedrecombinantEcoli；3：Thelysatepraecipitatumof0．5mMIPTGinducedrecombinantEcoli；4：TheJysatesupematantof0．5mMIPTGinducedrecombinantEcoli；5：ThelysatepraecipitatumoflmMIPTGinducerecombinantEcoli；6：Thelysatesupematantof1mMIPTGinducedrecombinantEcoli；3．3．2重组菌pGEX-gB2诱导表达的SDS-PAGE分析将重组质粒pGEX-gB2转化大肠杆菌BL21(DE3)，首先在不同温度条件下对其进行诱导表达，结果显示在25℃时可溶性蛋白含量最高，因此在25℃下，用不同浓度的IPTG诱导4h后经SDS．PAGE电泳，可见在36KDa处有高蛋白表达(见图2．6)，和预期大小一致，未诱导组上清和沉淀中都未表达出目的蛋白，而当IPTG浓度为0．1mM、0．5mM和1mM时裂解上清中在36KDa有明显条带，其中在IPTG浓度为0．5mM时表达量最大，所以最终选择在O．5mMIPTG浓度下对其诱导4h为最佳诱导条件，表达产物经超声波裂解后，融合蛋白主要存在于离心的上清中，提示融合蛋白表达后主要以可溶性蛋白的形式存在于菌体中。KDaM1234567811290503426 扬州大学硕士学位论文42图2．6重组蛋白GST-gB2的SDS．PAGE分析Fig．2-6SDS．PAGEanalysisoftherecombinantproteinGST-gB2M：蛋白Marker1：未诱导的重组菌裂解物沉淀；2：0．1mMIPTG诱导的重组菌裂解物沉淀；3：0．5mMIPTG诱导的重组菌裂解物沉淀；4：1mMIPTG诱导的重组菌体裂解物沉淀；5：未诱导的重组菌裂解物上清；6：0．1mMIPTG诱导的重组菌裂解物上清：7：0．5mMIPTG诱导的重组菌裂解物上清；8：1mMIPTG诱导的重组菌体裂解物上清M：ProteinMarker1：Thelysatepraecipitammofnon．inducedrecombinantEcoli；2：Thelysatepraecipitatumof0．1mMIPTGinducedrecombinantEcoli；3：Thelysatepraecipitatumof0．5mMIPTGinducedrecombinantEcoli；4：Thelysatepraecipitatumof1mMIPTGinducedrecombinantEcoli；5：Thelysatesupematantofnon．inducedrecombinantEcoli；6：ThelysatesupematantofO．1mMIPTGinducedrecombinantEco／／；7：Thelysatesupernatantof0．5mMIPTGinducedrecombinantEcoB；8：Thelysatesupematantof1mMIPTGinducedrecombinantEcoli3．4纯化的融合蛋白SDS．PAGE及Western．blot分析将纯化的融合蛋白GST-gBl和GST-gB2进行SDS-PAGE分析，由图可见，目的蛋白条带清晰可见，表明获得了较纯的融合蛋白。GST-gBl位置偏高，可能是由于纯化后融合蛋白的GST具有强电荷作用从而降低了蛋白的电泳速率，因此表观上偏大。用紫外分光光度计测定纯化的重组蛋白浓度，测得GST-gBI的浓度为1．3mg／mL，GST-gB2的浓度为1．1mg／mL。用PCMV阳性血清的为一抗，辣根过氧化酶标记的兔抗猪抗体为二抗进行Western．blot检测结果显示，在目的蛋白位置有明显的条带，说明目的蛋白的抗原性良好(如图2—7，2—8)。KDaM12345671129050342619 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立43图2．7GST-gBl的纯化及Western．blot检测结果Fig．2-7Western—blotdetectedresultandpraecipitatumofGST-gBlM：蛋白Marker1：重组菌pGEX．gBl诱导后裂解物上清：2：重组菌pGEX·gBl诱导后裂解物沉淀；3：重组菌pGEX．gBl诱导后裂解物沉淀纯化；4：空载体菌pGEX-6p·1诱导后裂解物上清；5：空载体菌pGEX-6p．1诱导后裂解物沉淀；6：空载体菌pGEX-6p-l诱导后上清纯化；7：GST-gBlWestern．blot检测结果M：proteinMarker1：Thelysatesupematantofnon-inducedrecombinantE．colipGEX·gBl；2：Thelysatepmecipitatumofnon—inducedrecombinantE．colipGEX—gBl；3：ThepraecipitatumpurificationofinducedrecombinantE．cofipGEX-gBl；4：ThelysatesupernatantofinducedvacantvectorE．cofipGEX·6p·l：5：ThelysatepraecipitatumofinducedvacantvectorE．cofipGEX一6p一1：6：ThesupematantpurificationofinducedvacantvectorE．colipGEX-6p·1：7：Westem-blotdetectedresultofGST-gBlKDaM1234567图2．8GST-ga2的纯化及Western．blot检测结果Fig．2-8Western-blotdetectedresultandpraecipitatumofGST-gB2M：蛋白Markerl：重组菌pGEX-gB2诱导后裂解物上清；2：重组菌pGEX-gB2诱导后裂解物沉淀：3：重组菌pGEx．gB2诱导后裂解物沉淀纯化；4：空载体菌pGEx-6p-1诱导后裂解物上清；5：空载体菌pGEX-6p．1诱导后裂解物沉淀；6：空载体菌pGEX-6p-1诱导后上清纯化：7：GST-gB2Western．blot检测结果8¨如∞弭；昌侈 扬州大学硕士学位论文4讨论M：ProteinMarker1：Thelysatesupematantofnon-inducedrecombinantE．colipGEX—ga2；2：Thelysatepraecipitatumofnon—inducedrecombinantE．cofipGEX-gB2；3：ThepraecipitatumpurificationofinducedrecombinantE．colipGEX-gB2；4：ThelysatesupematantofinducedvacantvectorE．cofipGEX·6p-1：5：ThelysatepraecipitatumofinducedvacantvectorE．colipGEX一6p-l；6：ThesupernatantpurificationofinducedvacantvectorE,cobpGEX一6p一1：7：Westem-blotdetectedresultofGST-gB2本实验采用了大肠杆菌系统中带有GST标签的融合型表达载体pGEX．6p．1，设计引物时在5’端添加了合适的限制性酶切位点和保护性碱基。克隆基因可插入GST标签的上游，形成C末端融合蛋白，融合蛋白表达系统可以克服转录和转录后水平对外源基因表达可能带来的不利影响，由于其包含了GST标签，可以方便用GSH．Sefmose进行分离与纯化。在纯化融合蛋白GST-gBl时，因其以包涵体形式存在，按参考文献【58】上的方法，变性复性后过GSH．Sefinose柱时发现不能结合，因此选用了切胶纯化法【坍】。本研究成功将gBl和gB2基因克隆到pGEX．6p．1表达载体中，构建了重组菌pGEX—gBl和pGEX-gB2，在摸索表达条件的过程中，尝试用不同的IPTG浓度、温度及诱导时间，但是GST-gBl摸索的各种条件下都是以包涵体的形式存在，最终确定在37℃时，IPTG浓度为O．5mmol／L，诱导4h为的最佳表达条件；而GST-gB2在大部分条件下是以可溶蛋白的形式存在的，也有部分以包涵体形式存在，但在25℃时，可溶性蛋白的含量明显高于包涵体蛋白，因此确定在25℃下，IPTG浓度为O．5mmol／L，诱导4h为GST-gB2最佳表达条件。目前诊断PCMV感染的方法主要是传统的血清学诊断法及后来发展的PCR方法，两种方法都存在弊端。传统的血清学诊断法需要借助于PAM或PFT-F细胞，而PCMV在PAM复制的很慢，PFT-F的应用也被证实不能够满足需要【l¨，并且在体外培养体系中滴定度较低、重复性较差，不能满足诊断试验和ELISA实验的抗 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基冈的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立45原需求量。PCR检测方法的实验成本高，对试验操作者的技术、实验室的条件要求也高，所以不适宜疾病的大规模普查。糖蛋白B(gB)是疱疹病毒感染的重要蛋白，是一个高含量的潜伏免疫原，本研究成功构建了gB!和gB2基因的原核表达系统，成功的表达了免疫原性强的gB蛋白，并经Western—blot分析证实表达的融合蛋白抗原性良好，因此为研究三中建立间接ELISA检测方法提供了充足的诊断抗原，并可能成为未来制备亚单位疫苗的首选蛋白。 扬州大学硕士学位论文研究三重组蛋白GST-gB2间接ELISA方法的建立摘要：以研究二中可溶性融合蛋白GST-gB2作为包被抗原，确定抗原的最佳包被浓度为2．0gg／mL，血清的最佳稀释度为1：100。在确定前两者的基础上，进一步确定了封闭时间为2h，一抗和二抗的最佳作用时间均为1h，显色时间为10min。用20份健康猪阴性血清的检测结果统计分析后确定诊断方法的判定标准，阳性临界值为0．224，阴性临界值为O．189，建立的ELISA方法的灵敏度为1：3200，通过特异性分析表明抗原不与其他猪病血清发生交叉反应。至此，初步建立了检测猪巨细胞病毒感染的间接ELISA方法。关键词：GST-gB2；间接ELISA；灵敏度；特异性l材料1．1主要试剂和仪器辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG抗体，显色底物邻苯二胺(OPD)购自华美生物工程公司；其余化学试剂为国产分析纯级。1．2仪器MINI．PROTEAN．II电泳仪(BIO—RAD公司)、TE70X半干转印装置(BIO—RAD公司)、酶联免疫阅读仪(DG3022A型国营华东电子管厂生产)。1．3实验材料1．3．1抗原包被用的抗原为研究二中所制备的重组蛋白GST-gB2，浓度为1．1mg／mL。1．3．2血清样品猪巨细胞病毒阳性血清和阴性血清来自临床采集，猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸道综合症及猪圆环病毒病阳性血清由本实验室保存。2方法2．1操作步骤： 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立47包被：用包被液稀释重组蛋白，加入酶标板中，每孔100¨L，4℃过夜；洗涤：倾尽酶标板孔内液体，加入0．05％PBST溶液100此洗涤，共洗3遍每次5min，在洁净的纱布(或吸水纸)上拍干；封闭：加入封闭液(含5％脱脂奶粉的PBST)100“L／孔，37℃作用2h。倾尽酶标板孔内液体，洗涤3遍，每次5min，拍干；一抗孵育：依次加入倍比稀释的血清样品100“L／孔，37℃作用1h，倾尽酶标板孔内液体，洗涤3遍，拍干；二抗孵育：加入用PBST进行1：5000稀释的酶标二抗100¨L／孔，37℃作用1h，倾尽酶标板孔内液体，洗涤3遍，每次5min，拍干；；显色：加入OPD底物显色液100肛L／孔，37℃避光静止作用10min。终止：加入终止液50“L／孔，终止反应。读数：酶标仪测OD490值。2．2间接ELISA最佳工作条件的确定2．2．1初步试验将融合蛋白分别稀释到8．0卜tg／mL、4．O肛g／mL、2．0pg／mL、1．0I_tg／mL、0．5I-tg／mL和0．25}lg／mL，100I．tL／q：L包被酶标板，每个稀释度两孔。用阳性血清和阴性血清作100倍稀释，二抗作5000倍稀释，做ELISA检测，具体步骤按2．1进行，同时设同样稀释度的纯化GST标签蛋白为对照。2．2．2抗原、一抗最佳工作浓度的确定将融合蛋白分别稀释到8．0“g／mL、4．0}lg／mL、2．0I_tg／mL、1．0“g／mL、0．5¨g／mL和0．25“咖L，100此／孔包被酶标板，每个稀释度两孔。用阳性血清和阴性血清分别作1：50、1：100、1：200、l：400稀释，二抗作5000倍稀释，做方阵实验检测，具体步骤按2．1进行。选择阳性血清OD490值接近于1．O，且阴性血清OD490值较低的抗原浓度和血清稀释度，从而确定最适抗原包被浓度和血清稀释度。2．2．3封闭时间、一抗作用时间、二抗作用时间及显色时间的确定在抗原和一抗的最佳工作浓度的条件下，将封闭时间分别做1h、2h及3h的比较；将一抗和二抗分别以37℃作用30min、60min和90min作比较；显色时间 扬州大学硕士学位论文分别做5rain、10min及15min的比较，具体步骤按2．1进行，对结果进行数据分析。2．3阴阳性临界值的确定按照已确定的间接ELISA方法的最佳条件，检测20份PCMV阴性血清。计算其OD490值的平均值(OD平均)及标准差(SD)。阳性临界值=阴性样本OD平均+3×SD，阴性临界值=阴性样本OD平均+2×SD。根据统计学原则，当OD490俭阳性临界值时，可以判定为阳性，当OD490值S阴性临界值时，可以判定为阴性，介于两者之间的为可疑，需复检。2．4特异性试验以阳性血清和阴性血清为对照，按已建立的间接ELISA方法对已知的猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)、猪繁殖与呼吸障碍综合症(PorcinereproductiveandRespiratorysyndrome，PRRS)及猪圆环病(Porcinecircovirus，PCV)等常见猪病的阳性血清进行测定，确定反应的特异性。2．5敏感性试验按所建立的ELISA方法，选择最佳抗原包被浓度包被，将阳性血清在稀释100倍的基础上做系列倍比稀释，同时设置阴性血清作对照。3结果3．1初步试验结果对纯化的GST-gB2进行了初步ELISA检测，测得的OD490值见表3．1，由表可知，阴性对照和纯化的GST标签蛋白的读值都明显较低，而纯化的融合蛋白与阳性血清的读值都远大于两组对照的读值，说明融合蛋白上的GST标签不影响特异性抗原与血清的反应。表3-1纯化的蛋白倍比稀释后的ELISA反应结果Table3-1ELISAresultofserialdilutedPurifiedprotein 赵锋祥猪巨细胞病毒gB基因的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的建立493．2抗原、一抗最佳工作浓度的确定采用方阵法确定抗原、抗体最佳工作浓度，结果见表3．2。当随着抗原浓度的减少和血清稀释倍数的增大，血清的OD490值不断降低，当重组蛋白的包被浓度为2pg／mL，血清作100倍稀释时，阳性血清与阴性血清的OD490值P／N比最大，为9．150。阳性血清OD490值在1．0左右，且阴性血清OD490值<0．2。一般酶联检测仪在OD值为1．0左右时误差最小，反应最敏感。据此，确定抗原的包被浓度为2¨g／mL，血清的稀释度为1：100。．表3-2重组蛋白最适包被浓度与一抗最适稀释度的确定Table3—2Determinationofthecoatingconcentrationofrecombinafionproteinandseradilutestrengths3．3封闭时间、一抗作用时间、二抗作用时间及显色时间的确定按照已建立的ELISA方法检测不同封闭时间、一抗作用时间、二抗作用时间及显色时间的00490值(血清、抗原均采用最佳工作浓度)，取平均值，计算P／N，以P／N值最大时为最佳作用时间，由表3．3可知，最佳封闭时间为2h，最佳一抗 扬州大学硕士学位论文作用时间为1h，最佳二抗作用时间为1h，最佳显色时间为10min。表3-3不同的封闭、一抗、二抗及显色时间对间接ELISA检测结果的影响Table3-3Theresultofvariousworktimeofblockade，mono-antibody，di-antibodyandcolorationiⅡindirectELISA3．4阴阳性临界值的确定在最佳抗原包被浓度和血清稀释度的条件下，对临床采集的20份阴性血清进行ELISA检测，读取OD490值见表3．4，确定阴阳性临界值。根据统计学原则，阳性临界值=阴性样本OD平均+3xSD=0．224，阴性临界值=阴性样本OD平均+2xSD=0．189，即在阴阳性对照成立的情况下，OD490位0．224时判断为阳性；OD490值