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1、ICs11。020CO5中华人民共和国国家标准GB/T26351-ˉ2010蜚蠊抗药性检测方法德国小蠊不敏感乙酰胆碱酯酶法Test1ⅡethodsoFcockroachresistancetoiⅡsecticidesˉˉTest1nethodsoFinsensitiveacetylchoIinesteraseForBlattellagermaⅡicazO11-0卜14发布2011-05-01实施中华人民共和国卫生部发布中国国家标准化管理委员会GB/T2635⒈-2010前言本标浪按照GB/T1.1-⒛09给出的规则起草。本标准由中华人民共和国卫生邯提出
2、并归口。本标准起草单位:北京市疾病预防控制中心、中国农业大学、中国人民解放军军事医学科学院傲生物流行病研究所。本标准主要起草人:曾晓亢、高希武、马彦、钱坤、佟颖、梁沛、赵肜盲。标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB/T2635⒈-2010蜚蠊抗药性检测方法德国小蠊不敏感乙酰胆碱酯酶法1范围本标准规定了德国小蠊(酶(AChE)的检测方法。本标准适用于德国甲酸酯类药剂抗学检测。2术语和定义下列术语和2.1乙酰胆碱能够抑制单位为mol/L或mmol/L。2.2F1代F1www.bzfxw.com从现场捕3试虫现场采集德条件下储存不超过ld,-20℃
3、条件下4试剂4.1磷酸氢二钠(NazHPo‘);4.2磷酸二氢钾(KH2Po4),化学窕4.3曲拉通Ⅺ100(TritonX-100)。4.4乙酰硫代胆碱(ATCD,分析纯。4.55,5’-二硫双硝基苯甲酸(DTN0,分析纯。4.6磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.5PBs):称取30.18gNazHPO4·12H20和2.16gKH2Po4,蒸馏水定容至1000mL。4.7DTNB-乙醇显色剂:称取12。4mgDTNB,溶于125mL95%乙醇中,加人50mL磷酸缓冲液,最后用蒸馏水定容至250mL,4℃避光保存。4.8ATCh溶液:称取28.9
4、mgATCh溶于10mL蒸馏水中,—zO℃避光保存。4.9ATC卜DTNB混合溶液:称取75mgATCh和13mgDTNB,用100mL磷酸盐缓冲液溶解。1GB/T2635⒈-20105分光光度法5.1仪器设备5.1.1分光光度计。5.1.2恒温水浴箱。5.1.3玻璃组织匀浆器。5.1.4台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。5.1.5加液器。5.2杀虫药剂的配制用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液稀释到区分浓度(常见杀,实验前用磷酸盐缓冲液A)的2倍,溶剂在反应体系中的最终浓虫药剂对敏感德国小蠊品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附录度应小于1%
5、。5.3操作步骤5.3.1将单头德国小蠊雄性成虫,放人4℃预冷的玻璃组织匀浆器中,加人1mL4℃预冷的磷酸盐缓冲液(pH7.5,0.1mol/L,含0.1%TritonⅪ100),充分匀浆。5.3.2匀浆液在4℃,10,000g,离心15min,弃沉淀,取上清即为酶液,冰浴保存各用。5.3.3取4支试www.bzfxw.com管,分别加人上述酶液0.1mL,在其中3支试管中分别加人杀虫药剂水溶液0.1mL,使其终浓度达到区分浓度,第4支试管中加人0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管;另取1支试管加人0.2mL磷酸盐缓冲液,作为空白对照。5.3.4将上
6、述5支试管于30℃保温5min,再分别加人0.1mL乙酰硫代胆碱(ATCh),30℃继续保温15min后,加入1.6mLDTNB一乙醇显色剂。5.3.5以空白对照调分光光度计0点,于狃2nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的光密度值(OD412)。5.3.6按上述方法检测100头德国小蠊。5.4结果表述测定AChE残存活性的计算见公式(1)。E=2坠×100%⋯⋯⋯¨⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯(1)OD式中:E——AChE残存活性;oDt——药剂处理管平均光密度值OD。12;oDc——无药剂对照管平均光密度值oD。12。5.5判别标准AChE残存活性大于20%
7、为不敏感的AChE。具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯类药剂具有抗性的个体,抗性个体在种群中的比例达到10%时为抗性种群。2标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB/T26351-ˉ20106酶标仪法6.1仪器设备6.1.1酶标仪。6.1.2恒温水浴箱。6.1.3玻璃组织匀浆器。6.1.4台式冷冻离心机(离心力10000g以上)。6.1.5加液器。6.2杀虫药剂的配制用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,实验前用磷酸盐缓冲液稀释到区分浓度(常见杀虫药剂对敏感德国小蠊乙酰胆碱酯酶的区分浓度参见附录A)的2.5倍,溶剂在反应体系中
8、的最终浓度应小于l%。6.3操作步骤6.3.1将单头德国小蠊雄成虫,放人4℃预冷的玻璃组织匀浆
