乙肝患者骨髓间充质干细胞乙肝病毒感染状况的研究

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1、中山大学硕￡学位论文乙肝患者骨髓间充质干细胞乙肝璃毒感染状况的研究乙肝患者骨髓间充质干细胞乙肝病毒感染状况的研究专业名称：内科学(传染病学)硕士研究生：李华导师：高志良教授摘要背景：乙肝是一种严重影响人类健康的全球性公共卫生问题，全球60亿人口中，有超过3．5亿人成为乙肝慢性感染者，每年可导致120万患者死亡。我国属于肝炎高发区，现患乙肝患者为2800万，每年大约有50万以上的患者因HBV感染导致的终末期肝病死亡，严重危害人民身体健康。对于乙肝的治疗，一直缺乏切实有效的方法，从内科综合处理、抗病毒治疗到肝移植手术治疗，都不同程度地存在各种缺陷，难以

2、达到彻底修复肝脏细胞功能，提高预后，改善生活质量，乃至恢复健康的目的。干细胞治疗是目前生命科学的研究热点，其中骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)以其取材容易，损伤小且便于自体移植，安全性高，没有异体排斥反应，便于外源基因的转染和表达调控，并且在一定条件下经体内外诱导可定向分化为肝细胞样细胞等优点，成为干细胞在乙肝及各种原因导致的终末期肝病方面的治疗应用的研究重点之一。众多研究表明，许多肝外组织如胰腺、胆管、肾、骨髓等均可检测到HBVDNA或乙肝免疫标志物，而乙肝患者MSCs中是否存在HBV感染尚无报道，本研究将从

3、抗原表达和病毒核酸表达两个层面了解乙肝患者MSCs中乙肝病毒的感染情况，同时，初步探讨在体外以ttBVDNA阳性血清培养的情况下MSCs能否被乙肝病毒感染，从而为自体MSCs移植治疗乙肝方案的完善提供实验依据。目的：中山大学硕士学位论文乙肝患者骨髓问充质干细胞乙肝病毒感染状况的研究1、明确乙肝患者MSCs中是否存在HBV感染；2、初步探讨体外培养的条件下，乙肝患者MSCs能否被HBv感染。材料与方法：一、标本来源乙肝患者骨髓34份，来源于我科住院病人，年龄27岁--57岁，均为男性，其中，20例患者血清HBVDNA定量阳性(阳性标准为>；，le3拷

4、贝／毫升)，HBVDNA最大值为3．31e7拷贝／毫升。健康人骨髓来源于志愿者。7份用于体外感染的HBVDNA阳性自体血清中，2份HBVDNA为107拷贝／毫升，5份为105拷贝／毫升。二、实验方法1、MSCs的分离、培养及鉴定抽取骨髓后以Percoll分离液(Sigma公司，美国)分离MSCs，用cult—M培养液或患者自体血清培养液接种至25cm2培养瓶中，均于5％C0。浓度下37℃培养，待细胞长至密度80％以上后进行传代培养。倒置相差显微镜观察形态，取Pl代细胞以流式细胞仪检测表面分子(CD34、CD44、CD45)。2、免疫组化法检测上述两

5、种方案培养的MSCs的HBsAg、HBcAg表达3、巢式PCR检测上述两种方案培养的MSCs的HBVDNA及cccONA结果：一、MSCs的观察及鉴定1、观察：倒置相差显微镜下～iSCs呈长梭形，体积小，核浆比大，呈均一的成纤维细胞形态，可聚集成均匀的集落；2、鉴定：流式细胞仪检测表面分子示Pl代乙肝患者MSCs中C034一CD44+者比例为93．88％，CD44+CD45～者比例为98．85％，与健康人MSCs一样，表面分子表达为CD34-CD44+CD45-。二、免疫组化1、Cult—M培养液培养的乙肝患者MSCsHBsAg、HBcAg染色均为

6、阴性；2、7份HBVONA阳性自体血清培养液培养的乙肝患者MSCsP1、P3、P5代HBsAg、HBcAg染色亦均为阴性：II中山大学颈卜学位论文乙肝患者骨铺问充质十细胞乙肝病毒感染状况的研究三、PcR阳性对照首轮PCR产物电泳后可见到280bp条带，次轮PCR产物电泳后可见到330bp条带，阴性对照两轮PCR均未见到条带。FBS及HBVDNA阳性自体血清培养的乙肝患者MSCs两轮PCR亦未见条带。结论：研究结果显示，无论患者血清HBVDNA阳性与否以及HBVDNA定量高低，MSCs中HI{sAg、HBcAg及HBVDNA均为阴性，这表明乙肝患者体

7、内的MSCs尚未受到HBV感染，且这种结果与乙肝病毒复制水平的高低无关。同时，7份以HBVDNA定量阳性的自体血清培养的乙肝患者MSCsPl、P3、P5代细胞中HBsAg、HBcAg及HBVDNA表达亦均为阴性，这7份患者自体血清中，HBVDNA定量2份为107拷贝／毫升，5份为105拷贝／毫升，这表明以HBVDNA阳性血清体外培养的情况下，MSCs亦不易受到HBV感染。关键词：乙肝患者；骨髓问充质干细胞；HBV中山大学硕士学位论文乙肝患者骨髓间充质干细胞乙肝旃毒感染状况的研究StudyofHBVmesenchymalinfectionstatus

8、ofmarrowstemcellsinhepatitisBpatientsMajor：InternalMedicine(i