b亚群禽白血病病毒灭活疫苗的制备免疫保护试验

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1、山东农业大学硕士学位论文中文摘要禽白血病是引起禽类产生肿瘤的主要疫病之一，其病原是反转录病毒科值反转录病毒属的禽白血病病毒(Avainleukosisvirus，ALV)。根据病毒囊膜糖蛋白的抗原结构、病毒宿主范围及在细胞培养上不同毒株之间的相互干扰作用，将ALV分为A～J10个亚群，其中A、B、C、D、E和J6个亚群存在于鸡群中。A、B和J亚群为鸡群中引发肿瘤的主要外源性ALV，而在鸡群中较少见由C、D亚群外源性ALV引发的肿瘤，E亚群病毒为内源性白血病病毒，对鸡的致病性很低或无致病。在上个世纪80年代以前，A、B亚群AL

2、V是引起鸡群淋巴性白血病和各种类型肿瘤的两类病毒，但在80年代中期，国际大型种鸡公司已基本消除了鸡群中A、B亚型ALV的感染。由于近几十年来我国从未在全国范围内进行对经典ALV的净化措施，我国鸡群特别是地方品系中极可能存在外源性ALV的感染。朱美珍等在山东某地方品系分离到一株A亚群禽白血病病毒，赵冬敏等在我国地方品系芦花鸡中分离到B亚群禽白血病病毒，说明我国鸡群中存在A、B亚群禽白血病病毒的感染。为加快B亚群禽自血病的净化，本实验成功制备了B亚群禽白血病病毒SDAU09C2株的灭活疫苗，尝试从核心种鸡群疫苗免疫的途径来减少核

3、心种鸡群的带毒率，提高其特异性抗体水平，从而保护其免受禽白血病病毒的感染，同时通过种蛋为下一代提供母源抗体，有效预防或减缓了雏鸡的早期感染，加快禽白血病的净化进程。要制备高质量的灭活疫苗，必须保证抗原的含量，因此我们首先探索B亚群禽白血病病毒SDAU09C2株的细胞培养的最优条件。将B亚群禽白血病病毒SDAU09C2株接种到对数生长期CEF细胞的12孔细胞培养板上中，孵育2h后，用含不同浓度初生牛血清(O．5％，1％，2％，3％)的DMEM培养液维持10天，每天每板每孔收集150ul细胞上清于1．5ml离心管中，用于p27抗

4、原检测，从而确定维持液最适血清浓度。然后再将SDAU09C2接种到对数生长期CEF细胞的24孔细胞培养板上中，孵育2h后，用不同PH值(6．6~7．7)含0．5％的初生牛血清的DMEM培养液维持10天，每天每板每孔收集150ul细胞上清于1．5ml离心管中，用于p27抗原检测，从而确定维持液最适PH值。最后将SDAU09C2株接种到对数生长期CEF细胞的细胞瓶中，接种2h后，用含PH为6．8，0．5％初生牛血清的DMEM培养液维持10天，每天每瓶各收集2个1．5ml离心管，每管150ul(一管用于p27抗原检测，一管用于TC

5、ID50滴度的测定)，从而确定p27和TCID50的关系。每次收集上清样品后补充等量的新鲜培养基。通过病毒连续细胞培养检B亚群禽白血病病毒灭活疫苗的制备及免疫保护试验测，发现病毒在PH为6．8，初生牛血清浓度为0．5％的维持液状态下，维持5天，复制出的病毒量最大而且p27和TCIDso间显著正相关。将SDAU09C2接种于20瓶新长成的单层CEF上，在培养瓶中盲传3代后，用PH=6．8小牛血清浓度为0．5％的维持液维持5天，收集带毒细胞，将收集的带毒细胞用PBS稀释至5ml，用体积比为0．2％的甲醛，在37℃培养箱内作用24

6、小时，将灭活的细胞与MONTANIDEISA775VG(佐剂)体积比为2．6：7．4进行充分乳化，制备出ALV-B灭活疫苗。9只成年祖代鸡多点注射制备的灭活疫苗lml(约含病毒106’8个TCID50)，未注射疫苗9只成年祖代鸡作为对照。在免疫过的成年产蛋鸡抗体水平最高时，分别从免疫组和未免疫组随机抽取4只免疫过的成年鸡和4只未免疫成年鸡进行攻毒，肌肉多点注射SDAU09C2lml(TCIDso为104‘6／0．1m1)，每周采集抗凝血、非抗凝血、棉拭子进行跟踪检测。剩余5只成年鸡经过四次免疫，每周采集非抗凝血0．5ml，进

7、行抗体检测跟踪。结果表明，免疫该疫苗后，在第三次免疫后的第三周抗体水平最高，S／P在1．69一-'1．89之间，阳性约维持四周。攻毒后的祖代鸡不论是免疫组还是对照组棉拭子p27全是阴性，也未出现病毒血症，说明成年鸡能够抵抗禽白血病病毒的感染，但对照组的S／P值比免疫组要高一些。免疫组的祖代鸡再次感染该病毒时，与对照组相比能够增强其免疫反应抗体水平更高。在免疫过的祖代鸡抗体水平最高时收集种蛋(包括无抗体对照组)进行孵化，孵出雏鸡33只，其中有抗体鸡的种蛋孵出的雏鸡17只，无抗体鸡的种蛋孵出的雏鸡16只。将雏鸡分为四组，一组为有

8、抗体鸡的种蛋孵出的14只小鸡，1日龄腹腔攻毒；二组为确定含母源抗体雏鸡3只，腹腔注射PBS(目的是看母源抗体消长规律)；三组为无抗体鸡的种蛋孵出的13只雏鸡，1日龄腹腔攻毒；四组为无抗体鸡的种蛋孵出的3只雏鸡，腹腔注射PBS，作为对照。每周采抗凝血、非抗凝血、棉拭子进行跟踪检测。结果显示：