坚强芽孢杆菌和短小芽孢杆菌表达载体构建的分析

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1、谨以此文献给为水产科学和水产事业倾注青春和不思劳苦的人们！——王海亮坚强芽孢杆菌和短小芽孢杆菌表达载体构建的分析学位论文答辩日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日---------------

2、------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。（保密

3、的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签字：签字日期：年月日签字日期：年月日坚强芽孢杆菌和短小芽孢杆菌表达载体构建的分析摘要有益菌(Probiotics)在工业生产和水产养殖中已有广泛的应用，芽孢杆菌(Bacillus)作为益生菌中的重要组成，作为微生态制剂或生物絮团的―添加剂‖在对虾的规模化养殖中产生了很高的经济效益。在水生动物疾病频发的形势下，病害微生物防控技术受到科学家的推崇，而芽孢杆菌以其独有的优势备受青睐。本实验采用的坚强芽孢杆菌(B.firmus)和短小芽孢杆菌(B.pumilus)均分离自正常的海水环境的野生菌。为了探索利用野生型芽孢杆菌进

4、行对虾白斑综合征(whitspotsyndrome,WSS)防控的新途径，分析以上两种菌在表达载体系统构建方面的应用潜力，为选择合适的表达载体宿主菌和构建稳定、高效的表达系统提供元件、方法。本论文研究内容共包括四部分：(1)坚强芽孢杆菌的鉴定及其16S-23SrDNA间区多态性分析；(2)坚强芽孢杆菌电转化方法的尝试；(3)坚强芽孢杆菌p43、hag基因的克隆及坚强芽孢杆菌特异性检测方法的建立；(4)短小芽孢杆菌应用于表达载体构建的潜力分析。1.坚强芽孢杆菌的鉴定及其16S-23SrDNA间区多态性分析：利用16SrDNA序列分析与系统发育分析表明PC004和PC024

5、均为B.firmus。利用16S-23SrDNAISRPCR方法，2株B.firmus共得到11条16S-23SrDNA间区特征区带(包0GIA括300bp、400bp、500bp和600bp等)序列，ISR类型包括ISR、ISR、ISR和GLV0GIAISR四种，其中ISR、ISR和ISR可能在B.firmus中普遍存在。相同类型的ISR序列具有较高的相似性(达52.2%-100.0%)，而不同类型的ISR序列间差异较大。此外，ISR序列在靠近16S和23S区域存在不同长度的保守区域，可能成为针对B.firmus特异性检测的引物和探针的靶区。2.坚强芽孢杆菌电转化方法

6、的尝试：尝试了用Xueetal(1999)报道的方法制备B.firmusPC004感受态细胞，并用pAD4412载体电转化B.firmus，但并没有实现质粒的有效转化。3.坚强芽孢杆菌p43、hag基因的克隆及坚强芽孢杆菌特异性检测方法的建立：首先，克隆了B.firmus的p43基因(431bp)。其次，简化的Leifson法(Clark,1976)成功染色B.firmus鞭毛，并确定其鞭毛为单端极生鞭毛，数量2根。再次，LC-MS/MS分析了得到了B.firmus鞭毛蛋白的18条肽段序列信息。通过IFCD-PCR和染色体步移获得了鞭毛蛋白的编码基因hag的全序列(Ge

7、nBankAccessionNo.KC683536)。该基因全长1661bp，有一个开放阅读框(openreadingframe,orf)编码414个氨基酸，预测分子量为44.2kDa，推断hag基因启动子核心D元件-10区和-35区被σ识别，并在其上游存在A+T富集区可能增强转录起始，在下游存在核糖体结合位点(ribosomebindingsite,RBS)(GGAGG)，且最后一个G与ATG间隔9nt。预测了可能具有启动子活性的Phag。此外，该基因含有一段B.firmus特异性肽段的编码序列。利用I-TASSER预测了鞭毛蛋白的结构