肺炎支原体耐药性及耐药机制研究

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1、肺炎支原体耐药性及耐药机制研究中文摘要肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，Mp)属于柔膜体纲支原体科支原体属，是有能力在体外不依靠活细胞生存、能够进行自我复制的最小微生物之一。研究表明肺炎支原体是引起社区获得性呼吸道感染的主要病原体之一，可引起支气管炎和非典型肺炎。肺炎支原体生长缓慢、培养周期长、体外分离培养比较困难，国内开展相关研究的单位很少。但只有获得肺炎支原体临床株才能进一步明确其生物学特性，了解肺炎支原体对目前常用抗菌药物的敏感性情况，进行分子流行病学研究，并开展新抗菌药物

2、对肺炎支原体的药效学评价工作。本研究建立了肺炎支原体临床株的分离培养方法，并进行连续收集和保存，建立了菌种库。采用经改良的微量稀释法测定药物敏感性，对大环内酯类耐药株进行了耐药机制研究和同源性分析。将CycleavePCR技术应用于肺炎支原体及其耐药性的快速检测。同时对肺炎支原体感染患儿的临床疗效进行了回顾性研究。第一部分肺炎支原体的分离培养本部分研究建立了从临床标本中分离培养肺炎支原体的方法，分离的临床菌株均良好保存。痰液标本来自2005年11月～2009年7月期间上海市儿童医院因呼吸道感染住院患

3、儿的鼻咽部吸取物。分离培养标准流程为：①呼吸道标本直接接种于液体培养基；②37℃孵育观察颜色变化；③液体培养基≥4天变为清亮、无混浊的黄色；④取100山加入1mlSP4液体培养基中，37。C孵育；⑤隔日观察，约5～7天后可再次观察到液体培养基变为清亮的黄色；⑥重复上述④⑤步骤2-3次即可得到肺炎支原体纯种：⑦采用PCR方法进行筛选和菌种鉴定；⑧菌种保存于一70℃及液氮中各一份。经过近五年的分离培养、纯化和冻存工作，我们成功分离并保存了152株肺炎支原体临床分离株。临床儿童呼吸道送检标本中肺炎支原体培

4、养总检出率约为4．8％(152／3159)。第二部分肺炎支原体的药物敏感性测定目前仍没有被普遍接受的支原体药敏试验标准方法，结果判定也尚无国际统一标准。更多学者倾向于采用微量稀释法进行支原体药物敏感性测定。文献报道的方法是在微量孔内进行抗菌药物及培养基稀释。我们对微量稀释法进行改进，采用试管法先将抗菌药物对倍稀释后加样至微量板，与微量板孔内稀释相比可增加稀释的准确性。3本研究部分采用改良的微量稀释法测定了10种常用抗菌药物对肺炎支原体临床分离株的药物敏感性。结果显示，四环素类(四环素、多西环素、米诺

5、环素)对肺炎支原体均具有良好的体外抗微生物活性。氟喹诺酮类中莫西沙星对肺炎支原体具有良好的体外抗微生物活性，MIC50和MIC90均为O．06mg／L，明显优于环丙沙星和左氧氟沙星。肺炎支原体临床分离株对红霉素的敏感性低，MIC50和MIC90均>128mg／L。90．1％(137／152)临床分离株对红霉素耐药，所有137株耐药株中135株的红霉素MIC>128mg／L，2株红霉素MIC为64mg／L。9．9％(15／152)的肺炎支原体临床株对红霉素敏感，MIC均<0．015mg／L。肺炎支原体

6、对阿奇霉素和克拉霉素的敏感性也明显下降，但阿奇霉素及克拉霉素的MIC值低于红霉素，阿奇霉素的MIC最高值为128mg／L，无>128mg／L的菌株。本研究中16环大环内酯类交沙霉素对肺炎支原体抗菌活性优于其他大环内酯类，MICso和MIC90分别为4及8mg／L。各年度肺炎支原体对红霉素的耐药率分别为，2005年60％(3／5)，2006年82．4％(14／17)，2007年100％(24／24)，2008年80．8％(42／52)，2009年100％(54／54)。第三部分肺炎支原体的基因分型上述

7、研究表明，肺炎支原体临床分离株对大环内酯类耐药率高，达90％以上。对于这些耐药菌是否存在克隆传播，需要进行分离株间的同源性分析以进一步明确。本部分研究分别采用经典的限制性片段长度多态性分析(RFLP)和多重位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)方法对肺炎支原体临床分离株进行分型。152株肺炎支原体临床株除2株外均可以采用PCR-RFLP方法进行分型。92．O％(138／150)属于P1．I型，8．0％(12／150)属于P1．II型。I型中红霉素敏感株占5．1％(7／138)，耐药株94．9％(1

8、31／138)；而II型中敏感株占66．7％(8／12)，耐药株占33．3％(4／12)。肺炎支原体PCR-RFLPI型的耐药率明显高于II型(x2--119．47，P<0．01)。采用MLVA分型方法，154株肺炎支原体(包括2株标准株)分为18种基因型(MTl～MTl8)，其中3个为独特类型仅含有一个菌株，其余15种基因型含有2或2株以上菌株，称为簇，最大的一簇含有21株肺炎支原体。簇内菌株在基因水平上存在亲缘性，具有同源性。MLVA(5位点)的分辨指数(HGI)