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1、Sox9与II型胶原蛋白在人腰椎间盘退变中表达和意义［摘要］目的探讨Sox9和II型胶原蛋白(Col2al)在人类腰椎间盘退变中的表达及意义。方法应用免疫组织化学在退变和正常腰椎间盘组织中分别检测Sox9和II型胶原蛋白的表达，并分析其相关性。结果实验组Sox9染色阳性率为20.0%(6/30),对照组Sox9染色阳性率为76.7%(23/30),两组间染色阳性率有显著性差异(P50岁，其中男16例，女14例，标本均经病理证实为退变椎间盘。选取腰椎外伤后路手术取出腰椎间盘标本30例作为对照组，患者年龄16〜30岁，标本均经病理证实为正常椎间盘，其中男
2、18例，女12例。1.2主要试剂Sox9兔多克隆抗体、Col2al鼠抗人单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，即用型超敏S-P免疫组化试剂盒、DAB显色液为福州迈新生物工程有限公司产品。多聚赖氨酸购自sigma公司。1.3实验方法1.3.1标本制备标本均经4%多聚甲醛固定6〜8h。常规脱水，石蜡包埋，4um切片,采用HE染色和免疫组化染色。1.3.2免疫组织化学染色采用S-P免疫组织化学染色超敏试剂盒，按期说明书进行实验。石蜡切片脱蜡至水，蒸馆水洗5minX2次，蒸馆水新鲜配制3%过氧化氢液，灭活内源性过氧化物酶，PBS洗3minX3次。将切片
3、浸入0.01M枸椽酸盐缓冲液，微波炉加热沸腾，5〜lOmin后，反复1〜2次；PBS洗3minX3次，封闭血清37*孵育lOmin；滴加一抗，41孵育12h,PBS洗3minX3次；滴加生物素标记的二抗，37°C孵育lOmin,PBS洗3minX3次；滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，37°C孵育lOmin,PBS洗3minX3次;滴加DAB显色剂，镜下确定反应时间终止。显色完成后，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封片；显微镜下观察染色结果。1.3.3染色结果的判断标准Sox9位于胞核，Col2al位于胞浆，阳性细胞染色呈棕黄色，随机
4、计数10个视野，阴性（-）判定为无阳性细胞或阳性细胞比例60%。1.4统计学方法采用SPSS15.0软件进行统计，两样本率的差别检验采用x2检验，相关性检验采用2X2列联表关联性分析，以a=0.05作为检验标准。2结果2.1退变腰椎间盘中Sox9的表达阳性细胞胞核呈棕黄色（图1A）O实验组Sox9染色阳性率为20.0%（6/30）,其中阴性（-）24例，弱阳性（+）2例,中度阳性（++）3例，强阳性（卄+）1例。对照组Sox9染色阳性率为76.7%（23/30）,其中阴性（-）7例，弱阳性（+）6例，中度阳性（++）10例，强阳性（+++）7例。两组
5、间染色阳性率差异有统计学意义（P2.3退变腰椎间盘中Sox9表达和Col2al表达的关系退变腰椎间盘中6例Sox9阳性者中，仅1例Col2al表达阴性，而在10例Col2al表达阳性者中，5例Sox9表达阴性，二者同时阳性5例，同时阴性表达19例。退变椎间盘中Sox9和Col2al的表达呈显著正相关(P[7]Kozhukhar，VG.SRYandS0X9：themaingeneticfactorsofmammaliansexdetermination[J]・Tsitologiia，2012,54(5)：390-404.[8]JakobS,Lovell
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