ⅰ型鸭肝炎病毒vp3截短基因的表达及应用

《ⅰ型鸭肝炎病毒vp3截短基因的表达及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、安徽农业大学硕士学位论文Ⅰ型鸭肝炎病毒vp3截短基因的表达及应用姓名：罗玄申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：潘玲；张小飞201205摘要咖删ⅢⅢ删㈣㈣舢舢删Y2150001鸭病毒性肝炎(Duckviralhepatitis，DVH)是一种急性病毒性传染病，主要表现有传播快、死亡率高，肝脏出现特征性出血。该病侵害4周龄以内的雏鸭，特别是3周龄以内的雏鸭最易感染，是危害养鸭业最为严重的传染病之一。VP3是鸭肝炎病毒(Duckhepatitisvirus，DHV)的主要结构蛋白之一，位于病毒壳体的表面，在VP3的氨基端含有主要的抗原决定簇，能够诱导机体发生免疫反应。通过对VP3

2、蛋白进行截短表达，为研究VP3蛋白的免疫学功能，也为鸭病毒性肝炎基因工程疫苗的研究奠定基础。研究随机选取I型鸭肝炎病毒(DuckhepatitisvimstypeI，DHV-I)印3基因的1—468位进行截短表达，并纯化表达所得融合蛋白，用此融合蛋白建立间接ELISA方法，初步应用于安徽省部分鸭场的DHV-I抗体检测。具体如下：首先根据GeneBank所登陆的I型鸭肝炎病毒(DuckhepatitisvirustypeI，DHV．I)A66株(DQ886445)印3基因序列，设计了一对扩增叩3截短基因(1．468)的特异性引物。将扩增的印3截短基因与原核表达载体PET．32“+)连

3、接，构建了印3截短基因的重组表达质粒pET．VP468。用Novagen公司pET系列载体通用引物T7promoterprimer(群69348-3)和T7temlinatorprimer(撑69337．3)对构建的重组质粒进行PCR鉴定，提取鉴定正确的重组质粒，与对照载体pET．32a(+)一起转入表达菌EC『D，fRosetta-gami(DE3)pLysS中，使用IPTG诱导表达，获得融合蛋白Trx．VP468。分析融合蛋白的表达方式并大量表达融合蛋白TrX．vP468。利用Ni2+．NTA亲和层析柱对表达蛋白Trx．VP468进行纯化，使用不同公司的BCA蛋白定量试剂盒测定

4、融合蛋白的浓度并进行Westem-blot分析。经SDS．PAGE电泳结果表明，pET．VP468在大肠杆菌中表达了一个相对分子量约为36kDa的蛋白。融合蛋白以不溶的包涵体形式存在。免疫印迹试验表明Trx．VP468得到了『F确表达。其次，以纯化的DHV—IA66株免疫SPF鸭制备高免血清作为阳性血清。初次免疫将弗氏完全佐剂与病毒等量混合并乳化完全，第二次和第三次免疫将弗氏不完全佐剂与病毒等量混合乳化，对sPF鸭进行免疫，抗原剂量约为300ug。三次免疫每次间隔10天，第二次和第三次免疫后1周采集血液制备血清并检测其抗体效价，效价符合要求者留作阳性血清。效价检测采用固定病毒——稀

5、释血清法，用已知毒价的病毒检测所制备阳性血清的抗体效价，最终测得阳性血清效价为1：90．51。最后，用Trx．VP468作为抗原包被酶标板，建立检测DHV．I抗体的间接ELISA方法。用十字交叉连续稀释分析法(criss．crossserial．dilutionanalvsis)确定ELISA方法中各试剂的最佳工作浓度；同时对一抗孵育时间、二抗反应时间、底物显色时间等条件进行优化；利用上述优化条件测定156份健康鸭的血清，计算出阴阳性血清临界值及结果判定标准。十字交叉连续稀释分析法确定最佳抗原包被量为10p∥ml，最佳血清稀释度为l：100，兔抗鸭二抗最佳稀释度为1：1000；一抗

6、孵育、二抗反应、底物显色最佳时间分别为1h，0．5h，15min：阴阳性临界值为0．372。应用建立的问接ELISA方法对安徽省部分地区临床收集的鸭血清进行抗体检测，331份鸭血清样品检测结果抗体检出阳性率为73．1％(242／331)。试验结果表明，甲3截短基因在大肠杆菌中获得了正确表达，所得重组蛋白经纯化后纯度较高。初步应用表达所得蛋白建立了间接ELISA方法，对安徽部分地区收集鸭血清样品进行DHV．I抗体检测，证明表达所得重组蛋白可以作为抗原用于检测DHV．I抗体。试验结果为DHV．I结构蛋白免疫学功能的研究以及基因工程疫苗的研发奠定了基础。关键词：鸭肝炎病毒，甲3截短基因，

7、原核表达，间接ELIsA方法AbstractDuckviralhepatitis(DHV)isanacuteinfectionofducklings，whichshowsrapidspread，highmortali够and够picalhemorrhagesintheliVer．Thediseasecausesaninfectioninducklingsfollowingfourweeksofageandespeciallyfollowingthreeweeksofa