超声辐照微泡促骨髓间充质干细胞修复急性肾小管坏死实验研究

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1、重庆医科大学博士学位论文超声辐照微泡促骨髓间充质干细胞修复急性肾小管坏死实验研究姓名：唐海林申请学位级别：博士专业：影像医学与核医学指导教师：王志刚201205重庆医科大学博士研究生学位论文超声辐照微泡促骨髓间充质干细胞修复急性肾小管坏死实验研究摘要急性肾功能衰竭(ARF)在临床上是常见的急危重症，尤其在重症监护室。大部分缺血和中毒所致的急性肾功能衰竭是可治的，但是，往往是伴有多器官衰竭的因素。实际上，尽管肾脏治疗有了很大的发展，医院内获得性急性肾功能衰竭的病死率并没有明显减少，仍高达30．80％。急性肾小管坏死(ATN)是缺血和中毒所致的急

2、性肾功能衰竭的主要原因。因此，怎么能够促进ATN后对其修复与再生，从而到达使ATN的死亡率降低。研究表明，生长因子在ATN肾小管皮细胞再生中起积极的作用。在动物ATN的模型上，用如下的生长因子治疗：上皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子I(IGF．1)及肝细胞生长因子(HGF)，可以改善其增殖再生，从而到达修复的目的。虽然在实验动物中，发现这些细胞因子促进ATN的再生和修复，但在人患有急性肾脏损伤后，用胰岛素样生长因子1对其进行治疗，疗效不佳。有学者推测，人体ATN的修复基金项目超声辐照微泡诱导肾微环境改变联合骨髓干细胞移植促急性肾小管坏死

3、修复研究，浙江省自然科学基金(Y2080071)靶向微泡携HIF．1a超声分子成像诊治心肌梗死及其机制研究，国家自然科学基金面上项目(81071158)重庆医科大学博士研究生学位论文有着十分复杂的病理生理过程，其修复可能涉及到肾微环境的网络蛋白综合作用，用单个基因产物来治疗作用非常有限。骨髓间充质干细胞是近年来研究的热点，越来越多应用于各种组织器官损伤的再生治疗，为组织器官的修复开辟了一条新的途径。骨髓干细胞移植是治疗ATN的一种新方法。骨髓干细胞在病理条件下会归巢至肾小管损伤部位，并分化为肾小管皮细胞，促进肾组织形态和功能改变。但是有一些学

4、者持怀疑态度，认为骨髓源性的间充质干细胞不能转化为肾小管上皮细胞。在参与肾损伤修复过程的间充质干细胞中，骨髓源性的间充质干细胞所占比例很少。用干细胞移植来治疗ATN并希望干细胞分化成肾小管上皮细胞的设想很难实现。因此，能改善骨髓干细胞移植治疗ATN的方法吗?干细胞植入的有效性及靶向性是干细胞移植治疗ATN的关键。而细胞间黏附分子表达有利于干细胞的归巢，提高干细胞移植的疗效，为骨髓干细胞治疗急性肾小管坏死提供了新的思路。近年人们在尝试药物及基因靶向释放的新方法(超声靶向破坏微泡)。超声介导微泡破裂后产生有如下的生物效应：内皮细胞间隙增宽，细胞因

5、子表达改变，中性粒细胞聚集，炎性反应等。感兴趣的是，超声辐照微泡后骨骼肌毛细血管内皮细胞粘附分子．1(ICAM．1)及血小板源生长因子PDF表达增加。在后来实验中也发现超声介导微泡后心肌组织毛细血管内皮细胞粘附分子．1(VCAM．1及ICAM．1)表达增加。而且应用超声介导微泡后产生的生物学效应，转导骨髓干细胞到下肢缺血模型中及转导内皮祖细胞到非缺血性心肌病，都取得了一定气重庆医科大学博士研究生学位论文疗效。后来应用聚焦超声及应用诊断超声介导微泡转导骨髓干细胞到缺血性心脏病模型，也有同样的效果。而未见报道将超声介导微泡的这种生物学效应应用于骨

6、髓干细胞移植到肾脏模型是否也是一种可行的方法。因此，我们尝试将超声介导微泡转导骨髓干细胞到大鼠ATN肾组织并促进ATN修复研究。超声介导微泡的生物学效应被广泛的关注及研究，微泡的空化效应可对周边的毛细血管壁造成一些微观的生物学反应，包括微血管的渗漏、毛细血管破裂、诱导周边细胞的凋亡及引起局部炎症反应等。尽管这些现象科发生在多个器官，但是肾脏似乎对上述的生物学效应更加敏感，这可能与肾小球毛细血管内血压较高有关，严重者可以引起持续出血，导致肾单位的损伤，甚至肾功能不全。因此，将超声介导微泡的这种生物学效应应用于骨髓干细胞移植到肾脏模型，超声辐照微

7、泡的条件需要优化。针对上述理论及存在的问题，本研究以二氯化汞(HgCl2)致大鼠急性肾小管坏死为模型，观察不同强度超声介导微泡后对肾组织微环境的影响，探寻合适超声辐照条件以达到干细胞移植治疗的目的。并在超声辐照介导改善肾微环境后进行4’，6．二脒基．2一苯基n9[(DAPI)标记的干细胞移植治疗，采用荧光显微镜观察MSCs在肾组织的分布情况，荧光定量PCR测定基因表达水平，Westemblot测定肾组织中蛋白质的表达情况，HE染色观察肾小管坏死后修复情况。共包括以下三个部分。重庆医科大学博士研究生学位论文第一部分：大鼠骨髓间充质干细胞的体外分

8、离、培养及鉴定目的：探讨一种体外分离、培养的高纯度大鼠间充质干细胞(MSCs)方法并对其鉴定。方法：为获得高纯度的间充质干细胞，采用如下方法：取大鼠胫骨及股骨骨髓，