农杆菌介导的枣树遗传转化研究

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1、河北农业大学博士学位论文农杆菌介导的枣树遗传转化研究姓名：郝征申请学位级别：博士专业：果树学指导教师：刘孟军；赵锦20120531摘要枣树(ZiziphusjujubaMill．)是我国原产重要果树。枣树由于花小、人工去雄难、坐果率低且胚败育现象严重，使得其杂交育种非常困难。枣疯病是由植原体引起致死性传染病害，几乎分布于国内外所有枣区，绝大多数枣树品种都对其敏感，已成为制约枣产业发展的严重障碍。随着生物技术的不断发展，基因工程已成为现代植物改良育种的有效手段。本研究旨在探索建立农杆菌介导的枣树遗传转化体

2、系，并利用发根农杆菌提高枣树对枣疯病的抗性，为枣树遗传改良和枣疯病防治提供技术支撑。主要研究结果如下：1．建立了冬枣的花药再生体系。诱导花药愈伤的适宜培养基为1／2MS+I．0mg／L2，4．D+209／L麦芽糖+5．59／L琼脂：花药愈伤的适宜增殖培养基为MS+0．4mg／LTDZ+0．1mg／LNAA+20∥L麦芽糖+5．59／L琼脂；1．0lIl∥LTDZ和0．4mg／LNAA的组合是诱导冬枣花药愈伤出芽的适宜生长调节剂组合，诱导出芽率达100％，平均出芽数为3．9个／块；0．2mg／LBA、0．

3、1mg／LIBA和1．5∥LPVA是玻璃苗恢复的适宜组合，玻璃苗恢复率为48．9％；在添加1．5mg／L认A的生根培养基中，生根率最高(43．3％)，根长最长(4．2cm)。2．首次建立了月光枣的花药再生体系。诱导花药愈伤的适宜培养基为1／2MS+I．0mg／L2,4一D+209／L麦芽糖+5．5∥L琼脂；月光花药愈伤的适宜增殖培养基为MS+0．6mg／LTDZ+0．1mg／LNAA+209／L麦芽糖+5．59／L琼脂。适宜月光愈伤分化出芽的培养基为：MS+5．59／L琼脂+209／L麦芽糖+0．8mg

4、／LTDZ+4．0mg／LAgN03。其诱导出芽率为100％，平均出芽数为10．4个／块；在培养基MS+5．59／L琼JJ旨+309／L蔗糖+0．2mg／LBA+0．1mg／LIBA+I．59／LPVA_中玻璃苗可恢复成正常苗；添加2．0mg／LIBA的生根培养基中月光生根率最高；GA3的添加对于枣愈伤的生长和玻璃苗的恢复均为抑制作用。3．建立了根癌农杆菌介导的冬枣叶片遗传转化体系。适宜的遗传转化条件为：根癌农杆菌的OD600为O．8，侵染20min后，在共培养基MS+5．59／L琼n旨+E09／L麦芽

5、糖+1．OmedLTDZ+0．1mg／LIBA+2009MAS(pn5．8)中暗培养3d。首次将双抗虫基因(Bt基因和蛋白抑制剂基因彳以)转入冬枣中，得到了8个转基因株系。4．建立了冬枣叶片及冬枣疯组培苗的发根农杆菌介导的遗传转化体系。冬枣叶片诱导毛根的适宜条件是在菌液浓度OD600为0．8时侵染叶片20min，在共培养基1／2MS+4．0medLIBA+5．5edL琼脂+309／L蔗糖(pH5．8)中暗培养3．5d，然后转接入培养基1／2MSo+CROlOoIIl∥L中，光照条件为光照／黑暗为14／1

6、0h。冬枣疯组培苗茎段诱导出毛根的适宜条件为：在菌液中添加50I．tM的AS预活化l~2h，OD600为0．8侵染5～10rain，共培养5d，共培养基为MS+5．59／L琼)l旨+209／L蔗糖+100mg／LCRO，光照条件为光照／黑暗为14／10h。首次通过发根农杆菌侵染使冬枣疯组培苗转化为正常植株，得到了30个抗病性提高的转健苗株系。关键词：冬枣，疯组培苗，遗传转化，房芒基因，蛋白抑制剂基因，根癌农杆菌，发根农杆菌，枣疯病抗性Agrobacterium-mediatedtransformatio

7、nofChinesejujubeName：HaoZhengMajor．PomologySuperviser：．ProfessorLiuMengjunProfessorZhaoJinAbstractChinesejujube(ZiziphusjujubaMill．)isanimportantnativefruittreeofChina．ConventionalCTOOSisverydifficultinChinesejujubeforreasonsofverylowfruit-setting，veryhi

8、ghembryoabortionaswellasverysmallflower．Withthedevelopmentofbiotechnology,geneticengineeringhasbecomealleffectivemeansformodemplantbreedingimprovement．Thisstudyisaimedattoestablishingallgenetictransformationsystemandlaying