g-csf对大鼠脑缺血再灌注模型脑组织内vegf表达的影响与脑保护作用

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1、内蒙古医学院硕士研究生学位论文(2008年)G—CSF对大鼠脑缺血再灌注模型脑组织内VEGF表达的影响及脑保护作用脑血管病是危害人类生命与健康的常见病和多发病，具有患病率高、复发率高、致残率高、死亡率高、并发症多的“四高一多”特点。而在所有脑血管病中以脑梗死的发病率最高，约占80％左右，给社会和家庭生活带来沉重的负担。所以找到脑梗死有效的治疗方法是神经病学的研究重点。超早期溶栓是治疗脑梗死较为有效的方法，但其严格的时间窗使这项治疗的应用受到了极大限制。虽然神经干细胞技术为缺血性脑损伤的治疗带来新的希望，但伦理学、细胞来源、移植损伤和排斥反

2、应等因素限制了其临床应用。因此寻找更为有效、更具可操作性的脑梗死治疗方法显得尤为重要。近年来，人们尝试用粒细胞集落刺激因子(Gran山ocyteCOlony—stimulatingFactor，G—CSF)作为动员剂，促使存在于骨髓中的造血干细胞进入外周血液循环来修复坏死心肌取得明显的效果。实验证明，G—CSF能使外周血干细胞数量增加，促使急性心肌梗死(AMI)后心肌和血管再生，减少心肌梗死面积，改善心功能，但是对于G—CSF促进心肌梗死区毛细血管增生的机制还不清楚。同时发现，干细胞也可以进人中枢系统并分化为神经干细胞、促进神经营养因子的

3、分泌⋯，从而起到神经保护作用。最新的研究显示，G—CSF可以对抗谷氨酸介导的小脑颗粒细胞死亡[2]，也可以抑制局部缺血区炎性因子肿瘤坏死因子一Q(硼盯一alpha)和诱导型一氧化氮合酶(烈OS)的表达[3]。这可能也是G—CSF在中枢神经系统发挥保护作用的部分机制。任何组织的修复均离不开血液系统。在G—CSF治疗缺血性疾病的实验中观察到，皮下注射G—CSF能促进大鼠脑和心肌损伤区毛细血管的生成[4]。血管新生是一个复杂的生理和病理过程，许多因子参与调节。其中血管内皮生长因子是促进血管生成的重要因子。血管内皮生长因子(VascularEnd

4、othdialGr。1哦hFkt。rⅥ巳GF)，又称血管通透性因子(Ⅵ)F)，主要由内皮细胞、单核巨噬细胞、成纤维细胞产生，另外平滑肌、骨骼肌细胞也可产生。其作用包括增加血管通透性和促进血管增生，是内皮细胞选择性有丝分裂原。ⅦGF是血管生成的主要刺激因子，其它血管生成因子的血管生成作用全部或部分通过增强Ⅵ三GF的表达发挥作用。实验证实，VEGF不仅可以通过刺激局部血管新生，为缺血区提供营养支持，还可以通过磷脂酰肌醇一3激酶(P13一I<／Akt)途径抑制Bc卜2内蒙古医学院硕士研究生学位论文(2008年)和su而vm的下调，这两种蛋白与抗

5、凋亡和抗兴奋性氨基酸毒性有关，从而发挥脑保护作用‘5

6、。虽然实验显示ⅥⅪF在脑组织可以发挥保护作用，但由脑缺血缺氧诱导的内源性VEGF表达数量很少，由此产生的自身修复能力有限。为了观察在脑梗死模型中，G—CSF对脑组织VEGF是否存在刺激作用，是否可以通过刺激VEGF表达发挥脑保护作用，为临床应用G—CSF治疗脑缺血性疾病提供理论依据，我们采用在局灶性脑缺血再灌注大鼠皮下注射粒细胞集落刺激因子的方法，观察其对动物神经功能缺失评分、脑梗死面积比及脑梗死周围损伤区组织中VEGF表达的影响等，探讨其脑保护作用的可能机制o1．材料与方法1．1主要

7、仪器、试剂及试剂配制1．1．1实验试剂兔抗大鼠ⅦGF试剂盒’淞试剂盒和Ⅸ蝎显色剂四红氮唑(丁rC)试剂粒细胞集落刺激因子水合氯醛PBS缓冲液1．1，2实验仪器电热恒温培养箱(Jc303型)全自动生物组织脱水机生物组织包埋机(JBM—A型)切片机kicall50C标本冷却台LeicaHIl210展片机卯一B烤片机光学显微镜图像处理软件数码相机1．1．3主要溶液的配制天津津脉生物工程有限公司上海科丰化学试剂有限公司山东科兴生物制品有限公司包钢医院药剂科福建迈新生物技术开发有限公司上海成顺仪器仪表有限公司沈阳市龙首电子仪器有限公司天津久圣医疗电

8、子仪器有限公司德国LEICA舢135上海莱卡仪器有限公司天津仪器有限公司德国0I．YMPUSBx60江苏捷达JD80l型形态学图像分析系统PanasonicDMC—I，1OGK内蒙古医学院硕士研究生学位论文(2008年)PBS缓冲液：福建迈新PBS缓冲液一小袋溶于2000“蒸馏水中备用。1vrC染色液：避光将0．5邸粉末加入25“PBs中，配成2％的染色液，放人4℃冰箱保存备用。4％多聚甲醛液：称取多聚甲醛粉末409，加入1000ml蒸馏水，煮沸、搅拌，配成质量分数为4％的多聚甲醛固定液。枸橼酸盐抗原修复液的配制：福建迈新公司枸橼酸盐一小

9、袋融入2000“蒸馏水中备用，PH值：6．0。粒细胞集落刺激因子：将G—CsF150越加入30Ild生理盐水中，配成5删“的G—CSF稀释液。1．2实验动物清洁Wistar大鼠40只，体重20