国标-猪繁殖与呼吸综合征诊断方法

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1、lCS11．220B41a园中华人民共和国国家标准GB／T18090--2008代替GB／T180902000猪繁殖与呼吸综合征诊断方法Diagnosticmethodsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome2008—12-31发布2009—05-01实施宰瞀鹳零瓣警矬赞翼发布中国国家标准化管理委员会仪1”GB／T18090--2008刖罱本标准的修订参照了世界动物卫生组织(OIE)编写的《陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽与蜜蜂)》(第五版，2004)。其技术内

2、容与OIE所推荐的基本一致。本标准代替GB／T180902000《猪繁殖和呼吸综合症诊断方法》。本标准与GB／T180902000相比主要变化如下：——增加了临床诊断；——免疫过氧化物酶单层试验作连续4倍稀释，结果的判定按照OIE编写的《陆生动物诊断试验和疫苗手册(哺乳动物、禽与蜜蜂)》(第五版，2004)的内容作了相应的修改；一一增加了反转录聚合酶链反应试验。本标准的附录A、附录B是规范性附录，附录C是资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位：中华人民共

3、和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙颖杰、苏永生、胡传伟、吴斌、李叶、贾贽、肇惠君。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：一一GB／T180902000。GB／T18090--2008猪繁殖与呼吸综合征诊断方法1范围本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征(PRRs)的诊断方法。本标准适用于猪繁殖与呼吸综合征的诊断。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这

4、些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB／T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB／T66822008，ISO3696：1987，MOD)3符号和缩略语下列符号和缩略语适用于本标准。bp——碱基对；CPE——致细胞病变作用；DEPC一一焦碳酸二乙酯；dNTP一脱氧核苷三磷酸；EB——溴化乙锭；HRP——辣根过氧化物酶；IFA一间接免疫荧光试验；IPMA一免疫过氧化物酶单层试验；PBS一一磷酸盐缓冲盐水}PRRs——猪繁殖与呼吸综合征；RNA——核糖核酸；RT—PcR——反转录一聚合酶

5、链反应；Taq酶——ThqDNA聚合酶。4临床诊断急性感染初期，猪群表现为食欲低下、发热、昏睡和精神不振等症状，个别猪可出现双耳、外阴、腹部、口部青紫发绀，一般持续1周～3周；发病高峰的主要特征是母猪早产、流产以及木乃伊胎和弱仔增多；仔猪断奶前死亡率增加，高峰期一般持续8周～12周；发病末期，母猪繁殖功能逐渐恢复，达到或接近病前水平。仔猪和育肥猪存在不同程度的呼吸系统症状，痊愈猪一般生长缓慢，体重较轻。若没有继发感染，除发病仔猪可见间质性肺炎等特征病变外，一般不表现肉眼可见病变。有以上临床症状者，可以怀疑猪群有猪繁殖

6、与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染，确诊需要实验室检验。IGB／T18090--20085病毒的分离与鉴定5．1材料准备5．1．1器材二氧化碳培养箱、普通冰箱及低温冰箱、倒置生物显微镜、恒温水浴箱、离心机及离心管、96孔细胞培养板、微量移液器、组织研磨器、孔径o．2pm的微孔滤器及滤膜。5．1．2试剂RPMI1640细胞培养液、MEM细胞培养液、犊牛血清、青霉素(104Iu／mL)与链霉素(104pg／mL)溶液、7．5％碳酸氢钠溶液等。5．1．3细胞猪原代肺泡巨噬细胞培养物(PAM)、MARC-145。PAM由未感

7、染过PRRS猪群中6周龄～8同龄的猪获取，并经批次检验合格，制备和检验方法见附录A。5．1．4样品5．1．4．1采样无菌采取扁桃体、肺、淋巴结和脾等组织，血清或腹水置低温保存盒内立即送检。不能立即检测者，应放一20℃冰箱中，长期保存应置于一70℃冰箱中。5．1．4，2制备血清和腹水可直接检测。肺、脾和扁桃体等组织可单独检测，也可混合后检测。各组织剪碎后研磨成糊状，加入RPMll640，制成10％的组织悬液，以3000r／rain离心15min，吸取上清液，加入青霉素500IU／mL、链霉素500pg／mL、庆大霉素5

8、00pg／mL和两性霉素B200pg／mL。怀疑有细菌污染的样品，也可用0．2pm微孔滤膜过滤处理。5．2操作方法5．2．1制备细胞板已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离株特别是欧洲型病毒株的生长，因此病毒分离应首选PAM细胞，先将PAM细胞用RPMll640稀释(含犊牛血清5％，青霉素100IU／mL、链霉素100pg／mL、庆大霉素50p